基于信號擴增策略構建的高靈敏熒光適體傳感器用于檢測腺苷.pdf

1、生物傳感器是將目標物識別過程轉換成信號并有效輸出的一種快速檢測和監(jiān)控裝置，其在許多領域有著廣泛的應用，如藥物分析、生物技術、環(huán)境保護和臨床診斷等。適體的介入為傳感器的研究發(fā)展提供了新的動力。由于其高特異性和高結合力的固有性質，以適體為識別元素的傳感器成為近年來研究的熱點。到目前為止，多種信號轉導的適體傳感器已經被建立，其中，熒光適體傳感器因其儀器設備操作簡單、靈敏度高、選擇性好、響應快速、且對樣品不會造成破壞等優(yōu)點，得到廣泛應用。本文的

2、研究工作是利用生物化學分析的新技術構建新型的熒光適體傳感器用于檢測目標物。
　　腺苷是一種內源性核苷，同時也是重要的藥物小分子，在生理和藥理方面發(fā)揮著重要作用，如舒張血管、控制平滑肌收縮等，是人體生理活動的重要調節(jié)者。其在中樞神經系統(tǒng)、周圍神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中均起著重要的作用。此外，據文獻報道，腺苷還可作為癌癥的潛在標志物。因此，腺苷的檢測對心血管疾病、神經系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤的診斷和治療等方面都具有重要的意義[153

3、-159]。
　　目前，大量的腺苷適體傳感體系已被構建用于腺苷的分析檢測，然而由于腺苷在正常人尿液和血清中含量極低，它們的靈敏度往往不夠理想，不能直接用于復雜生物樣本（人尿液和血清）中腺苷的定量檢測（據報道正常人尿樣中腺苷濃度范圍在2.0×10-6molL-1到7.0×10-6mol L-1之間，血清中腺苷濃度范圍在5.0×10-8mol L-1到1.0×10-7mol L-1之間）[176，178]。而生物樣本中腺苷的檢測在臨床

4、研究和疾病的診斷和預防方面具有較高的臨床應用意義，例如生理條件下腺苷含量的波動可用于心、腦生理功能的研究，尿液中腺苷含量的升高可用于腫瘤的早期診斷。因此，如何提高傳感器的靈敏度，并實現(xiàn)復雜生物樣本中低腺苷含量的檢測是目前腺苷檢測面臨的重要問題。本文利用高效的信號擴增策略，構建了新穎且通用的熒光適體傳感器，使腺苷的靈敏度有了很大提高，并可達到生物樣品中的定量檢測。
　　本文第一章為緒論部分，首先對生物傳感器進行了概述，并著重介紹了熒

5、光適體傳感器的特點、優(yōu)勢和應用前景;其次，對常用的信號擴增策略進行了概述;最后，介紹了腺苷檢測的意義、現(xiàn)有方法、腺苷適體傳感器及面臨問題。
　　本文第二章，利用外切酶Ⅲ輔助的DNA循環(huán)和雜交鏈反應(HCR)的雙重放大作用，構建了一種免標記且靈敏的熒光適體傳感器用于檢測腺菅。在該方案中，首先設計了一個包含催化鏈、適體鏈和鏈霉親和素化磁球的三功能探針。當目標物被適體鏈識別之后，催化鏈會立即被釋放。然后，催化鏈觸發(fā)ExoⅢ輔助的DNA循

6、環(huán)，產生大量的DNA片段，從而獲得第一次放大。隨后，DNA片段作為觸發(fā)鏈引發(fā)HCR，形成帶有許多G-四分體結構的雙螺旋，獲得了第二次放大。最終，熒光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)插入到G-四分體結構中，產生增強的熒光響應，實現(xiàn)了免標記的檢測。該方法的檢測限為4.2×10-7molL-1。此外，該方法特異性良好，并且能夠區(qū)分癌癥病人和正常人尿樣中腺苷的含量，為腺苷的檢測提供了一種新的可靠的定量方法。
　　雖然上述構建的適體傳感器

7、成功且靈敏的對腺苷進行了檢測，但是，在實驗過程中，為了獲得低背景信號，我們引入了磁球對目標物進行富集和分離。然而，磁球的引入需要對其進行修飾、活化和分離，這無疑增加了操作上的復雜性和實驗的成本。為此，我們展開了下一個工作，也就是本文的第三章，利用聚合切刻循環(huán)反應和發(fā)卡結構催化自組裝（CHA）的雙重擴增機制，構建了一種均相中檢測腺苷的新方法。該方法設計了一個含有腺苷適體、切刻酶識別位點和CHA觸發(fā)鏈互補堿基的發(fā)卡探針。當目標物存在時，適體

8、識別腺苷使得發(fā)卡探針構象發(fā)生改變，在聚合酶、dNTPs和切刻酶的作用下，發(fā)生聚合切刻循環(huán)反應，產生大量單鏈DNA;此步為第一次擴增;然后，單鏈DNA作為CHA的引物鏈，觸發(fā)CHA生成大量帶有G-四分體的雙鏈DNA，此步為第二次擴增;最終插入熒光染料NMM，實現(xiàn)熒光信號的免標記檢測，檢測限達到1.3×10-7mol L-1。該檢測限比其他檢測腺苷的免標記方法降低了兩個數量級[171，175]，較本課題組降低了約50倍[148]。該方法可實