基于納米材料和生物放大技術(shù)構(gòu)建高靈敏電化學(xué)適體傳感器的研究.pdf

1、電化學(xué)適體傳感器是將適體—配體特異性識(shí)別技術(shù)和電化學(xué)分析方法相結(jié)合而發(fā)展起來的一種集信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)檢測(cè)、特異性識(shí)別反應(yīng)為一體的新型生物傳感器。它同時(shí)兼具以上兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢出限低、選擇性和重現(xiàn)性好。近年來，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病標(biāo)志物等的高靈敏測(cè)定以達(dá)到對(duì)疾病的早期檢測(cè)，新型納米材料和信號(hào)放大策略被廣泛用于適體傳感器的構(gòu)建中。本文利用不同種類的納米材料作為生物分子的固載基質(zhì)，同時(shí)將電化學(xué)傳感技術(shù)與納米放大技術(shù)、酶催化放大

2、等放大策略相結(jié)合，構(gòu)建了幾種新型檢測(cè)體系用于對(duì)目標(biāo)蛋白等的高靈敏檢測(cè)。其主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.基于石墨烯放大而構(gòu)建的一個(gè)用于凝血酶檢測(cè)的高靈敏電化學(xué)適體傳感器
　　由于納米材料好的生物相容性，大的比表面積，優(yōu)良的電催化活性，迷人的導(dǎo)電性等，其不僅被廣泛用于增加電極的比表面積和促進(jìn)電極界面間的電子轉(zhuǎn)移，還被用來固載大量的生物分子或其他物質(zhì)，從而放大電化學(xué)信號(hào)。例如，石墨烯(Gra)因其獨(dú)特的性能，被用于傳感器界面的構(gòu)建時(shí)

3、可展現(xiàn)出以下等優(yōu)點(diǎn):首先，提供了充足的電化學(xué)活性表面用于生物分子固定。其次，提供了一個(gè)完美的微環(huán)境，得以保留生物分子的生物活性。最后，Gra還可以充當(dāng)一個(gè)電子轉(zhuǎn)移通道，有效地加速電極和檢測(cè)分子之間的電子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致更快速和靈敏的電流響應(yīng)。本研究工作中，我們制備了一個(gè)具有高特異性和良好穩(wěn)定性且檢測(cè)限低的免標(biāo)記型凝血酶適體傳感器。利用Nafion的成膜性，首先將由Nafion、石墨烯(Gra)及鐵氰化鎳(NiHCFNPs)組成的復(fù)合物(N

4、f-Gra-NiHCFNPs)滴加在預(yù)先處理好的電極表面并晾干。再通過電沉積的方法在修飾電極表面引入金納米粒子(AuNPs)。所得的AuNPs不僅可以用來固定凝血酶適體(TBA)，還能增加復(fù)合膜的穩(wěn)定性。凝血酶適體(TBA)通過適體上的巰基與金形成Au-S鍵而將TBA共價(jià)吸附在電極表面，從而成功制備能用于凝血酶(TB)檢測(cè)的電化學(xué)適體傳感器。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該適體傳感器的優(yōu)點(diǎn)在于:一方面，該適體傳感器利用Gra來增大電極的比表面積，從而提

5、高TBA的固載量;另一方面，利用Gra和AuNPs的強(qiáng)導(dǎo)電能力來促進(jìn)電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高該適體傳感器的檢測(cè)靈敏度。
　　2.基于Hemin/G-quadruplex過氧化物模擬酶和辣根過氧化物酶修飾的碲化鐵納米棒而構(gòu)建的一個(gè)三重放大的高靈敏凝血酶適體傳感器
　　近年來，研究者們熱衷于將多種放大手段聯(lián)用來取代原有的單一放大技術(shù)，從而更好地放大響應(yīng)信號(hào)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的超靈敏檢測(cè)。在此，我們報(bào)

6、告了一個(gè)理想的三重放大的凝血酶(TB)生物識(shí)別系統(tǒng)，此處Hemin/G-quadruplex過氧化物模擬酶（HRP-DNAzyme）、碲化鐵納米棒(FeTe NRs)及辣根過氧化物酶(HRP)共同實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。歸功于這些放大因素，本次制備的適體傳感器對(duì)TB的檢測(cè)展現(xiàn)出非常良好的分析性能，極大地提高了該適體傳感器的靈敏度。除此之外，該分析策略還可以為基于適體的夾心分析系統(tǒng)提供一個(gè)新的模型。首先，在玻碳電極上沉積一層納米金(AuNPs)以便

7、將凝血酶適體1(TBA1)固定在電極表面。作為電子媒介體的電活性物質(zhì)硫堇(Thi)被首先固定在金納米粒子修飾的碲化鐵納米棒（AuNPs@FeTe NRs）上。隨后，氨基標(biāo)記的凝血酶適體2(TBA2)通過適體的氨基與AuNPs@FeTe NRs的相互作用而被固定在含Thi的復(fù)合納米材料表面。具有大量鳥嘌呤的TBA2不僅可與Hemin形成具有生物催化性能的Hemin/G-quadruplex結(jié)構(gòu)，還可同時(shí)作為生物識(shí)別探針。緊接著，HRP作為

8、封閉劑來封閉可能存在的活性位點(diǎn)。值得一提的是，F(xiàn)eTe NRs在此不僅作為理想的載體，同時(shí)還作為一種過氧化物模擬酶。對(duì)于所制備的適體傳感器，在H2O2的存在下，Thi的還原峰電流被明顯放大。
　　3.基于核酸外切酶催化的目標(biāo)物循環(huán)及DNA多聯(lián)體放大而構(gòu)建的可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)的適體傳感器
　　與測(cè)定單組分的傳統(tǒng)方法相比，多組分的同時(shí)檢測(cè)可以提供一些潛在的優(yōu)點(diǎn)，如更短的分析時(shí)間和過程，更小的樣本需求量，更高的測(cè)試效率和更低

9、的檢測(cè)成本。因此，設(shè)計(jì)一種電化學(xué)適體傳感器用于多個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)是必要且非常重要的。近幾年，酶催化的目標(biāo)循環(huán)和DNA多聯(lián)體各自均被廣泛地用于信號(hào)放大。但直至今日，還沒有關(guān)于將以上兩種完美的放大策略聯(lián)合起來的報(bào)道。因此，聯(lián)合兩種放大策略來提高適體傳感器的靈敏度是很有前景的。本研究中，我們成功構(gòu)建了一個(gè)基于核酸外切酶催化的目標(biāo)物循環(huán)及DNA多聯(lián)體放大的，可實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶(TB)和赭曲霉毒素A(OTA)同時(shí)檢測(cè)的電化學(xué)適體傳感器。先前雜化好的

10、雙鏈DNA（SH-cTBA/TBA及SH-cOBA/OBA）通過自組裝固定在電極上。在有目標(biāo)物存在的情況下，適體與目標(biāo)物特異性結(jié)合時(shí)不僅會(huì)導(dǎo)致適體(TBA和OBA)從雙鏈DNA中解離出來，還會(huì)使互補(bǔ)DNA（SH-cTBA和SH-cOBA）轉(zhuǎn)變成發(fā)卡型結(jié)構(gòu)。隨后，由于引入了對(duì)單鏈DNA特異性片段具有剪切能力的核酸外切酶（RecJf exonuclease），目標(biāo)物便可以從適體與目標(biāo)物結(jié)合的復(fù)合物中游離出來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)。緊接著，引入探針D