基于乙肝病毒基因突變分析的乙肝個(gè)體化診斷與應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的乙型肝炎是世界性傳染病,同時(shí)也是中國最嚴(yán)重的傳染病,在中國具有30年以上的傳染史。其高發(fā)的耐藥性以及誘發(fā)肝硬化/肝癌導(dǎo)致了嚴(yán)重的中國醫(yī)療問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。HBV基因組(HBV-DNA)由不閉合的雙鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)DNA組成,含約3200個(gè)核苷酸,主要分為P、C、X、S四個(gè)區(qū)。HBV DNA具有高度突變性,并由此形成了HBV DNA不同的基因型。耐藥的產(chǎn)生和肝硬化/肝癌的發(fā)展與乙肝病毒基因型和基因突變直接相關(guān)。本課題觀察了西

2、北地區(qū)較大樣本量的乙肝患者HBV基因突變的情況,發(fā)現(xiàn)了系列新的HBV遺傳特性以及新的病程標(biāo)志性位點(diǎn),詳細(xì)分析了基因型、基因突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性,為最終建立乙肝病毒感染相關(guān)性疾病的個(gè)體化診斷奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一:乙型肝炎病毒基因生物信息學(xué)分析及引物設(shè)計(jì)
　　通過使用生物信息學(xué)分析方法,針對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中包含A~H8個(gè)基因型的49例HBV基因組全序列進(jìn)行blast分析比較,獲得了HBV P(S)基因區(qū)可覆蓋8個(gè)型的分型基

3、因片段、P基因突變熱點(diǎn)區(qū)擴(kuò)增片段、BCP-PreC/C基因區(qū)突變熱點(diǎn)擴(kuò)增片段,設(shè)計(jì)了相應(yīng)區(qū)域PCR擴(kuò)增引物;實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了各目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序的可行性,建立并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。
　　實(shí)驗(yàn)二:HBV P基因區(qū)突變分析與核苷類藥物治療耐藥相關(guān)性研究
　　使用生物信息學(xué)分析以及Sanger測(cè)序法,針對(duì)HBV未用藥者、核苷類藥物治療發(fā)生臨床耐藥的慢性乙肝患者血液標(biāo)本以及肝硬化/肝癌患者組織樣本,進(jìn)行了所感染的HBV P基因區(qū)測(cè)

4、序分析,對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果應(yīng)用自主研發(fā)軟件HBV liner、HBV drug guide和NCBI Genotyping tool軟件的對(duì)比分析,證實(shí)了HBV liner軟件能夠有效判斷基因型;HBV drug guide軟件能夠準(zhǔn)確分析基因變異;數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,中國西北地區(qū)HBV感染者的基因型分布以C基因型為主(59.31％),B基因型其次(38.35%),D基因型較少(2.34%),未見A基因型;P區(qū)基因在核苷類藥物的壓力下出現(xiàn)r

5、t169(43.40%)、rt180(47.17%)、rt181(1.89%)、rt202(5.67%)、rt204(32.08%)、rt236(3.77%)、rt250(1.89%)突變,其中rt169突變與恩替卡韋相關(guān),rt180突變與拉米夫定、恩替卡韋和替比夫定相關(guān),rt204突變與拉米夫定和替比夫定相關(guān);發(fā)現(xiàn)了B基因型存在rt169和rt180的天然突變,突變比例在未用藥組、耐藥組和肝硬化肝癌組達(dá)到平均99%以上,rtI169同

6、義突變與rtL180F錯(cuò)義突變的產(chǎn)生可能與長期藥物壓力下進(jìn)化相關(guān),該2個(gè)突變具有潛在遺傳變異性,說明我國乙肝存在遺傳漂變可能性。
　　實(shí)驗(yàn)三:HBV BCP-PreC/C基因區(qū)突變分析與肝硬化/肝癌的臨床相關(guān)性研究
　　使用生物信息學(xué)分析以及Sanger測(cè)序法,針對(duì)HBV未用藥者的外周血標(biāo)本、肝硬化/肝癌患者的手術(shù)切除病理標(biāo)本,進(jìn)行了所感染的HBV BCP-PreC/C基因區(qū)突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析,對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了

7、自主研發(fā)軟件HBV drug guide的對(duì)比分析,證實(shí)了HBV drug guide軟件對(duì)該區(qū)域突變分析的可行性和優(yōu)勢(shì)性;發(fā)現(xiàn)該區(qū)域基因在未用藥組和肝硬化/肝癌組臨床標(biāo)本中具有1762/1764位置的多發(fā)突變,突變比例平均50%以上,以ALT、AST數(shù)值40U/L為界限,關(guān)聯(lián)性對(duì)比其他位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)1762/1764的突變與未突變樣本間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05,1762/1764突變與肝損傷呈正相關(guān);1896/1899突變?cè)谖从?/p>

8、藥組中以HBeAg<1為界限,關(guān)聯(lián)性對(duì)比1762/1764等其他位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)1896/1899的突變與未突變樣本間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.0001。1896/1899突變與HBeAg呈負(fù)相關(guān);首次發(fā)現(xiàn)了HBV B基因型感染者存在G1799C新突變,在肝硬化/肝癌組的B基因型樣本中發(fā)現(xiàn)G1799C突變與未突變比例具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.0001,G1799C與肝硬化/肝癌呈正相關(guān)性,由于其與X蛋白變異相關(guān),說明該位點(diǎn)可作為乙肝病毒導(dǎo)致