野生型p53基因與ADM聯(lián)合作用于人肝癌耐藥細(xì)胞株的研究.pdf

1、目的：建立人肝癌BEL7404耐藥株，并檢測(cè)該耐藥株的生物學(xué)特性，為應(yīng)用基因技術(shù)逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?方法：通過(guò)鹽酸阿霉素(ADM)長(zhǎng)期篩選建立人肝癌細(xì)胞耐藥株BEL7404/ADM。應(yīng)用四甲基偶氮唑(MTT)法及流式細(xì)胞儀(FCM)對(duì)該細(xì)胞株的相關(guān)特性(藥物敏感性、倍增時(shí)間、P-糖蛋白功能、細(xì)胞周期)進(jìn)行系統(tǒng)研究。 結(jié)果：ADM濃度梯度遞增法連續(xù)作用BEL7404細(xì)胞10個(gè)月，得到肝癌細(xì)胞耐藥株BEL740

2、4/ADM。經(jīng)MTT法檢測(cè)耐藥株IC<,50>是敏感株的68.7倍，耐藥細(xì)胞的倍增時(shí)間延長(zhǎng)了6.49h，羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)證實(shí)耐藥株的P-糖蛋白活性高于敏感株，兩者細(xì)胞周期無(wú)明顯差異性。 結(jié)論：成功建立了人肝癌BEL7404耐藥細(xì)胞株，該細(xì)胞株的生物學(xué)特性明顯不同于敏感細(xì)胞株；多藥耐藥性主要與P-糖蛋白的高表達(dá)有關(guān)。 目的：通過(guò)轉(zhuǎn)染野生型p53基因(wt-p53)并聯(lián)合鹽酸阿霉素作用于人肝癌細(xì)胞耐藥株BEL7404/

3、ADM及其敏感株，研究二者聯(lián)合作用對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥性的影響。 方法：將克隆有wt-p53的pUHD 10-3質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體(梭華-Sofast<'TM>)介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染肝癌敏感株BEL7404和耐藥株BEL7404/ADM，同時(shí)，在培養(yǎng)液中加入ADM，用MTT法分析細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)改變；流式細(xì)胞儀對(duì)它們的細(xì)胞周期和凋亡情況進(jìn)行分析。最后用羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)聯(lián)合作用對(duì)耐藥株P(guān)-gP活性的影響。

4、 結(jié)果：Wt-p53轉(zhuǎn)染敏感株和耐藥株后，細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到抑制：在轉(zhuǎn)染第4天，敏感細(xì)胞BEL7404的生長(zhǎng)抑制率達(dá)52.53％，ADM作用組的生長(zhǎng)抑制率達(dá)46.03％，聯(lián)合作用組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制最明顯，為73.86％。而耐藥細(xì)胞BEL7404／ADM轉(zhuǎn)染p53的生長(zhǎng)抑制率達(dá)47.01％，單獨(dú)ADM作用為53.72％，聯(lián)合作用后生長(zhǎng)抑制率最高，為69.15％。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，聯(lián)合作用對(duì)兩種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀分析兩種

5、細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果為：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染p53基因，不能阻滯任何一種細(xì)胞，同時(shí)也不促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；同樣單獨(dú)ADM作用細(xì)胞雖能被阻滯在G2期，能促進(jìn)敏感株凋亡的發(fā)生，但對(duì)耐藥株無(wú)促進(jìn)作用。而聯(lián)合作用后細(xì)胞均被阻滯在G<,1>期，不僅能促進(jìn)敏感株凋亡的發(fā)生還能促進(jìn)耐藥株凋亡的發(fā)生，且凋亡率是最高的(敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的凋亡率分別為27.8％和25.9％，兩者凋亡率無(wú)顯著性差異)。羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)顯示ADM作用耐藥株96h后其細(xì)胞P-gp的活