PCDH8和LRRC55基因異常甲基化在胰腺癌發(fā)病中的作用研究.pdf

1、胰腺癌(pancreatic carcinoma)是消化系統(tǒng)較常見、惡性程度較高的腫瘤，進展迅速，手術(shù)切除率低，預后極差，近幾年來發(fā)病率在國內(nèi)外均有逐年上升趨勢。由于胰腺癌在臨床上缺乏特異表現(xiàn)，在就診時3/4的病人已屬晚期，確診病例手術(shù)可切除率僅為4％～27％，世界上每年有胰腺癌新發(fā)病例約20萬人，占全部惡性腫瘤發(fā)病的2％，其死亡率與發(fā)病率十分接近，每年死亡人數(shù)約19.6萬人，5年生存率＜5％。因此，深入研究胰腺癌的分子發(fā)病機制顯得十分

2、必要。
　　 表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的前提下調(diào)控基因的表達。表觀基因組學則是在基因組水平上對表觀遺傳學改變的研究。表觀遺傳學包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及由非編碼RNA調(diào)控的mRNA表達等。近年的大量研究表明，遺傳學中基因啟動子區(qū)甲基化程度的改變對疾病的發(fā)生發(fā)展起重要作用。甲基化對基因的表達有著重要的調(diào)控作用，另外它還同基因組印記、女性X染色體的基因滅活、細胞增殖、分化發(fā)育、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展以及遺傳的不穩(wěn)定性等密切相

3、關(guān)。隨著深入的研究，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化成為闡明正常和病理基因表達現(xiàn)象的重要機制，且在腫瘤的早期診斷和病人愈后判斷方面也有廣闊的應用前景。
　　 基于上述研究現(xiàn)狀，本課題首先利用甲基化基因芯片技術(shù)進行胰腺癌甲基化異?；虻暮Y查，發(fā)現(xiàn)新的胰腺癌異常甲基化基因PCDH8(protocadherin8)和LRRC55(1eucine rich repeat containing55)，為胰腺癌的早期診斷和防治提供理論基礎(chǔ)。進一步進行了兩條

4、基因在胰腺癌中的甲基化、表達等方面的研究，初步探討了兩條基因的功能。
　　 一、胰腺癌異常甲基化基因的芯片篩查
　　 目的：本研究利用以微陣列技術(shù)為基礎(chǔ)的甲基化基因芯片，篩查胰腺癌異常甲基化基因，為胰腺癌的早期診斷找出更好的甲基化基因診斷靶標。
　　 方法：以4例胰腺癌及癌旁組織為研究對象，抽提并超聲處理DNA，甲基化富集，將擬行對比分析的DNA樣品分別行Cy3、Cy5標記，與甲基化基因芯片進行雜交，洗片，用激光

5、掃描儀對芯片進行掃描，并用NimbleScan軟件分析Cy3和Cy5的強度，用SignalMap軟件以Cy3和Cy5比值大于2為標準篩選胰腺癌高甲基化基因，并在不同組織間比較找出胰腺癌高甲基化基因，同時進行胰腺癌高甲基化基因的定位分析。
　　 結(jié)果：初步研究了胰腺癌及癌旁組織樣品DNA與甲基化芯片雜交結(jié)果，通過對比分析發(fā)現(xiàn)其中第11、13號染色體CpG島有較多的CpG甲基化區(qū)域高甲基化，分析結(jié)果為第11號染色體LRRC55和第1

6、3號染色體PCDH8。
　　 結(jié)論：通過甲基化基因芯片篩查，發(fā)現(xiàn)高甲基化的CpG區(qū)域并定位，為尋找胰腺癌異常高甲基化基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、胰腺癌中PCDH8基因的甲基化、雜合性缺失和表達的檢測
　　 目的：檢測PCDH8基因在胰腺癌中甲基化狀態(tài)、雜合性缺失狀態(tài)、mRNA及蛋白表達。
　　 方法：首先收集2株胰腺癌細胞株、2例胰腺及癌旁組織、2例正常胰腺組織作為研究對象，健康成人外周血液標本2例作為對

7、照組，應用BSP克隆測序法檢測PCDH8基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況。通過MSP和QMSP法檢測PCDH8基因在6株胰腺癌細胞株和64例人胰腺癌及相應癌旁胰腺組織中的甲基化狀態(tài)。采用PCR+STR法檢測PCDH8基因在36例人胰腺癌及相應癌旁胰腺組織中的雜合性缺失狀態(tài)。應用實時定量PCR方法檢測59例人胰腺癌及相應癌旁胰腺組織中PCDH8mRNA的表達和6株胰腺癌細胞株在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5Aza-dC)處理前后mRNA的表達

8、情況。利用免疫組織化學的方法檢測42例人胰腺癌組織及癌旁胰腺組織和6例正常胰腺組織中PCDH8蛋白的表達部位及表達水平。
　　 結(jié)果：BSP克隆測序法檢測結(jié)果表明PCDH8基因在2株胰腺癌細胞株和2例胰腺癌組織中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)(平均甲基化百分數(shù)分別為95％，52％)，而在2例正常胰腺組織、2例癌旁組織和2例外周血液中為低甲基化狀態(tài)(平均甲基化百分數(shù)分別為4％，6％，5％)。通過MSP法檢測PCDH8基因在Pancl、BxPC3

9、和CFPAC胰腺癌細胞株中部分甲基化，AsPC1、PaTu8988和SW1990胰腺癌細胞株完全甲基化；QMSP法檢測胰腺癌組織甲基化率高于癌旁組織，甲基化率分別為0.015(0，0.074)，0.0004(0，0.025)(P＜0.05)。雜合性缺失檢測結(jié)果D13s1228位點無雜合性缺失，D13s270位點雜合性缺失率為41％(13/32)。實時定量PCR檢測結(jié)果為胰腺癌組織mRNA相對表達量(RQ)低于癌旁組織，RQ分別為0.03

10、(0.01，0.14)，0.09(0.02，0.35)(P＜0.05)。應用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理人胰腺癌細胞株，處理后mRNA相對表達量明顯高于處理前。PCDH8基因在各細胞株表達情況：AsPC-1在處理前無表達，5Aza-dC處理后RQ為12.55；BxPC3在處理前無表達，5Aza-dC處理后RQ為5.59；Pancl在處理前RQ為1.10，5Aza-dC處理后RQ為6.76；SW1990在處理前RQ為0.004，5Aza-

11、dC處理后RQ為5.24；PaTu8988在處理前RQ為0.001，5Aza-dC處理后RQ為116.08；CFPAC在處理前RQ為0，5Aza-dC處理后RQ為592.63。免疫組織化學檢測結(jié)果提示，PCDH8蛋白在胰腺癌組織中惡變的胰腺導管上皮細胞胞漿少量表達(9/42)，間質(zhì)細胞胞漿大部分表達(28/42)；在癌旁組織中胰腺導管胞漿少量表達(2/42)，間質(zhì)細胞胞漿少量表達(5/42)；在正常胰腺組織中胰腺導管腺泡無表達。胰腺癌組

12、織中間質(zhì)的表達高于癌旁組織，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：PCDH8基因在胰腺癌中呈高甲基化狀態(tài)；PCDH8基因在人胰腺癌組織中處于低表達狀態(tài)；胰腺癌中PCDH8基因存在雜合性缺失；PCDH8基因啟動子甲基化參與其基因的表達調(diào)控，基因啟動子高甲基化是導致在胰腺癌中的低表達的重要原因；免疫組織化學檢測提示胰腺導管癌細胞少量陽性，癌旁組織與癌組織的間質(zhì)陽性存在差異。
　　 三、胰腺癌中LRRC55基因的甲基化和

13、表達的檢測
　　 目的：檢測LRRC55基因在胰腺癌中甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白表達。
　　 方法：首先收集2株胰腺癌細胞株、2例胰腺癌及癌旁組織、2例正常胰腺組織作為研究對象，健康成人外周血液標本2例作為對照組，應用BSP克隆測序法檢測LRRC55基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況。通過QMSP檢測LRRC55基因在64例人胰腺癌及相應癌旁胰腺組織中的甲基化狀態(tài)。應用實時定量PCR方法檢測42例人胰腺癌及相應癌旁胰腺組織中

14、LRRC55 mPA的表達。利用免疫組織化學的方法檢測31例人胰腺癌組織及癌旁胰腺組織和6例正常胰腺組織中LRRC55蛋白的表達部位及表達水平。
　　 結(jié)果：BSP克隆測序法檢測結(jié)果表明LRRC55基因在2株胰腺癌細胞株和2例胰腺癌組織中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)(平均甲基化百分數(shù)分別為71％，53％)，而在2例正常胰腺組織、2例癌旁組織和2例外周血液中為低甲基化狀態(tài)(平均甲基化百分數(shù)分別為11％，8％，9％)。通過QMSP法檢測LRRC

15、55基因胰腺癌組織甲基化率高于癌旁組織，甲基化率分別為0.016(0.0002，0.077)，0.003(0，0.078)，兩組之間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。實時定量PCR檢測結(jié)果為胰腺癌組織mPA相對表達量低于癌旁組織，RQ分別為0.14(0，1.03)，0.99(0.19，3.69)，兩組之間表達量有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。免疫組織化學檢測結(jié)果提示，LRRC55蛋白在胰腺癌組織中惡變的胰腺導管上皮細胞胞漿大部分表達(27/

16、30)；在癌旁組織中胰腺導管胞漿部分表達(20/30)，腺泡細胞胞漿大部分表達(17/23)；在正常胰腺組織中胰腺導管和腺泡細胞無表達。胰腺癌組織中癌細胞的表達與癌旁組織無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：LRRC55基因在胰腺癌中呈高甲基化狀態(tài)；LRRC55基因在人胰腺癌組織中處于低表達狀態(tài)；免疫組織化學檢測提示胰腺導管癌細胞多數(shù)陽性，癌旁組織與癌組織之間無差異。
　　 通過上述研究，本課題得出以下結(jié)論：