大鼠氣管干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中ABCG2的表達(dá)及Wnt信號(hào)機(jī)制的研究.pdf

1、干細(xì)胞是指具有無(wú)限或較長(zhǎng)期的自我更新能力，并能產(chǎn)生至少一種高度分化子代細(xì)胞的細(xì)胞。按照組織發(fā)生學(xué)來(lái)源，可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。近年來(lái)對(duì)成體干細(xì)胞的研究越來(lái)越受到重視，目前已發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞有造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肌干細(xì)胞、角膜干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞等，并已不同程度地用于臨床治療。但迄今為止國(guó)際上對(duì)氣管干細(xì)胞的研究還很不完善。先前本研究組已成功地在體內(nèi)外建立了氟脲嘧啶介導(dǎo)的大鼠氣管損傷

2、修復(fù)模型，并對(duì)氣管干細(xì)胞進(jìn)行了初步的定位和性狀解析。 干細(xì)胞具有排出熒光染料Hoechst33342的特性。近年來(lái)的研究表明，干細(xì)胞的這一特性(即SP表型)與ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一的ABCG2(又名乳癌耐藥蛋白1，Bcrp1)的表達(dá)有關(guān)。現(xiàn)已證明在多個(gè)物種的多種組織來(lái)源的SP細(xì)胞中檢測(cè)到ABCG2的高表達(dá)，如骨髓、肝、肌組織、乳腺上皮及ES細(xì)胞。ABCG2與SP表型的密切關(guān)系，使得ABCG2成為多潛能干細(xì)胞

3、的共同標(biāo)志，對(duì)干細(xì)胞的鑒定具有重要意義。為更深入地了解氣管干細(xì)胞的特性，本研究在5-FU介導(dǎo)的氣管上皮損傷修復(fù)模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用間接免疫熒光法和Weternblot動(dòng)態(tài)觀測(cè)了修復(fù)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)氣管上皮ABCG2蛋白的表達(dá)，借以原位觀察了氣管干細(xì)胞在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)分布。 近年來(lái)的研究表明Wnt信號(hào)及其成員對(duì)胚胎及成體的原始細(xì)胞的增殖和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。為探討氣管干細(xì)胞的增殖分化與Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的關(guān)系

4、，闡明干細(xì)胞增殖分化的分子機(jī)制，本研究應(yīng)用RT-PCR及間接免疫熒光的方法動(dòng)態(tài)觀測(cè)了修復(fù)過(guò)程中Wnt信號(hào)相關(guān)成分Wnt1、β-catenin、cyclinD1mRNA的變化以及β-catenin蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布，初步探討了Wnt/β-catenin信號(hào)途徑參與調(diào)控氣管干細(xì)胞增殖分化過(guò)程的可能機(jī)制。 材料和方法： 1.離體氣管損傷模型的制備：200g左右的Wistar大鼠，雌雄不限，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(經(jīng)中國(guó)醫(yī)科

5、大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意)，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，無(wú)菌條件下取出氣管，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)，剪成約2-3mm的氣管環(huán)，于倒置顯微鏡下觀察纖毛擺動(dòng)良好，取一組織塊作正常對(duì)照；于培養(yǎng)液中加入終濃度為120mg/ml的5-FU，37℃，5％CO2孵育12小時(shí)，棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮DMEM/F12(含10％胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，于換液后0、3、6、9、12、24、48小時(shí)分別取出一組織塊，10％中性福爾馬林

6、固定，石蠟包埋，制成4μm厚的組織切片。另取換液后各時(shí)間點(diǎn)的氣管組織及正常氣管組織，解剖顯微鏡下機(jī)械剝離上皮，放于1.5mlEppendorf管中，-70℃保存，以備總蛋白和總RNA的提取。 2.將石蠟切片做HE染色，光鏡觀察并照相。 3.間接免疫熒光法檢測(cè)氣管上皮ABCG2表達(dá)：石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，非免疫動(dòng)物血清封閉，一抗用ABCG2，二抗為TRITC標(biāo)記兔抗山羊IgG，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。50％緩沖甘油封片

7、，熒光顯微鏡Olympas-BX51下觀察并照相。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用等量的0.01mol/LPBS代替一抗，其余步驟同前。 4.氣管上皮ABCG2蛋白的半定量檢測(cè)：取5-FU作用前后的氣管上皮組織，提取總蛋白質(zhì)。用Westernblot分析ABCG2蛋白的表達(dá)情況。 5.應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Wnt信號(hào)相關(guān)成分Wnt1，β-catenin，cyclinD1mRNA的表達(dá)：按TrizolTM試劑使用說(shuō)明提取剝離的氣管上皮總R

8、NA，引物序列如下：Wnt1sense5’-AGGTGAAAGGGCAAGGAA-3’，antisense5’-CTGGCAGACAAGAGGAGTGA-3’(304bp)；β-cateninsense5’-GCGCTCCCCTCAGATGGTGTC-3’，antisense5’-ACGATGGCCGGCTTGTTGC-3’(500bp)；cyclinD1sense5’-TGGCGTTTGGAAGTAGGG-3’，antisense5’

9、-GAGCGGCGGCAAGAATGT-3’(420bp)；β-actinsense5’-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’，antisense5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’(587bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，Bio-Rad凝膠圖像成像儀觀察并記錄結(jié)果，測(cè)灰度值。 6.制備氣管上皮細(xì)胞涂片：取正常及5-FU作用后的氣管組織，于換液后0、3、6、12、2

10、4、48小時(shí)分別取出氣管組織，蛋白酶XⅣ消化，涂于載玻片上，固定。-20℃保存。 7.氣管上皮細(xì)胞涂片β-catenin間接免疫熒光檢測(cè)：將氣管上皮細(xì)胞涂片用正常山羊血清封閉，一抗用兔抗β-catenin，二抗為山羊抗兔TRITC標(biāo)記的IgG，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，50％緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡OlympasBX51下觀察并照相。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用等量的0.01mol/LPBS代替一抗。 結(jié)果： 1.5-FU作用12h

11、后，氣管上皮全部脫落，殘留間隔分布的裸核樣細(xì)胞(即G0期細(xì)胞)，其中部分細(xì)胞管腔側(cè)胞膜呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光信號(hào)，即為ABCG2的膜陽(yáng)性表達(dá)；去除5-FU后3小時(shí)，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，大部分為扁平狀，ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨之增多；恢復(fù)6小時(shí)，上皮細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)增多，同時(shí)ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增多，強(qiáng)紅色熒光信號(hào)在管腔表面形成不連續(xù)的線狀；至恢復(fù)24小時(shí)，上皮細(xì)胞呈立方狀，并連接成片，ABCG2陽(yáng)性信號(hào)較前明顯減少，散在分布于少數(shù)細(xì)胞管腔側(cè)膜上；恢

12、復(fù)48小時(shí)，氣管上皮接近恢復(fù)假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)，此時(shí)僅見(jiàn)極少量ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞。正常氣管上皮未檢測(cè)到ABCG2的強(qiáng)紅色熒光信號(hào)表達(dá)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性。 2.Westernblot結(jié)果顯示ABCG2蛋白在氣管損傷修復(fù)過(guò)程中各時(shí)相的表達(dá)有明顯差異。去除5-FU后恢復(fù)0小時(shí)僅有極少量表達(dá)，而后其水平呈增加趨勢(shì)，至6小時(shí)達(dá)到高峰，恢復(fù)12、24小時(shí)ABCG2表達(dá)量依次減弱，至48小時(shí)只有輕度表達(dá)；正常氣管上皮表達(dá)陰性。 3.RT-P

13、CR結(jié)果顯示在正常大鼠氣管上皮無(wú)Wnt1mRNA的表達(dá)，β-cateninmRNA輕度表達(dá)，cyclinD1mRNA無(wú)表達(dá)。在經(jīng)5-FU作用后恢復(fù)0小時(shí)，此時(shí)即可檢測(cè)到Wnt1mRNA的表達(dá)，β-cateninmRNA一時(shí)性輕度下降。去除5-FU后3小時(shí)觀測(cè)到扁平的上皮細(xì)胞，此時(shí)Wnt1mRNA水平增加并達(dá)到高峰，β-cateninmRNA在6小時(shí)達(dá)到高峰，cyclinD1mRNA在12小時(shí)達(dá)到高峰。24小時(shí)上皮細(xì)胞數(shù)目增多，呈立方狀，

14、并連接成片，可見(jiàn)纖毛及粘液顆粒，此時(shí)三者表達(dá)水平均下調(diào)，48小時(shí)接近恢復(fù)假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，此時(shí)Wnt1及cyclinD1mRNA無(wú)表達(dá)，β-cateninmRNA少量表達(dá)。 4.重建過(guò)程中β-catenin的核移位：對(duì)取自不同時(shí)間點(diǎn)的氣管上皮細(xì)胞的間接免疫熒光染色結(jié)果顯示，在正常的氣管上皮細(xì)胞，β-catenin定位于細(xì)胞膜；在去除5-FU后6小時(shí)及12小時(shí)，β-catenin出現(xiàn)明顯的胞漿內(nèi)蓄積及核移位；至48小時(shí)修復(fù)基本完

15、成時(shí)又恢復(fù)為膜表達(dá)。 結(jié)論： 1.在5-FU介導(dǎo)的氣管上皮損傷修復(fù)模型的基礎(chǔ)上動(dòng)態(tài)觀測(cè)了修復(fù)過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)氣管上皮ABCG2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明ABCG2的表達(dá)與干細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，可作為氣管干細(xì)胞的標(biāo)志物，為氣管干細(xì)胞的分選提供了條件。 2.Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控氣管干細(xì)胞增殖分化全過(guò)程。修復(fù)早期促進(jìn)氣管干細(xì)胞的增殖，修復(fù)后期促進(jìn)祖細(xì)胞向特定的細(xì)胞分化。該研究有助于理解干細(xì)胞自我更新和