大鼠氣管干細胞增殖分化過程中Notch信號分子的表達及意義.pdf

1、本研究利用5-FU介導的大鼠氣管上皮損傷修復模型，檢測了大鼠氣管干細胞增殖分化過程中Notch信號分子的表達及意義。 材料和方法： 1、離體大鼠氣管損傷修復模型的制備及DAPT和Jag-1處理 取約200克左右的Wistar大鼠，雌雄不限，水合氯醛麻醉，無菌條件下取出氣管，PBS沖洗，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10％胎牛血清)。取正常氣管，剪取一氣管環(huán)固定，留做石蠟切片，灌入蛋白酶XIV(0.5mg/ml)

2、，結扎另一端，4℃消化過夜，收集消化液，加FCS至終濃度為2.5％終止酶反應收集正，常氣管上皮細胞于2mlEppendorf管中，-70℃凍存，留做mRNA。其余氣管組織分為DAPT預處理組、Jag-1預處理組、對照組、DAPT處理組和Jag-1處理組。DAPT及Jag-1預處理組先在培養(yǎng)液中加入5μM DAPT或40μM Jag-1，37℃，5％CO2孵育12小時，棄去上述培養(yǎng)液，于DMEM/F12(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液中加入終濃

3、度為120mg/ml的5-FU，37℃，5％CO2孵育12小時，棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮DMEM/F12液(含10％胎牛血清)；對照組單純5-FU作用；DAPT處理組和Jag-1處理組在5-FU作用后換為含有5μM DAPT或40μM Jag-1的DMEM/F12(含10％胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，方法同上，分別于換液后0、3、6、12、24、48小時取出氣管組織分別固定，留做石蠟切片；消化，收集細胞于2mlEppendorf管中，-70℃保

4、存，以備RNA和蛋白提取。 2、RT-PCR檢測 按TrizolTM試劑使用說明提取氣管上皮細胞總RNA，檢測它的濃度，純度和完整性。按逆轉錄試劑盒使用說明操作，選用Oligo-dT做引物合成第一鏈cDNA，逆轉錄條件為：30℃ 10min，40℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min；PCR反應條件為：94℃變性2min后，94℃ 30s，退火，72℃ 1min，進行30個循環(huán)，最后于72℃延伸7min。擴增產

5、物使用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色分析表達結果，測灰度值，統(tǒng)計。相同條件下用β-actin作為內對照。 3、蛋白印跡檢測 按蛋白抽提試劑盒說明抽提氣管上皮細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，50V恒壓濕轉120mins，BSA室溫封閉2hrs，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2hrs，DAB顯色。轉膜后各步之間均用洗膜液洗膜3次，每次5mins。相同條件下用β-actin作為內對照。 4、間接免疫熒光檢測氣管上

6、皮ABCG2，CK19，Notch3和Jagged1的表達 連續(xù)切片，石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，非免疫動物血清封閉，一抗分別為Goat anti-ABCG2,Rabbit anti-CK19，Rabbit anti-Notch3和Goat anti-Jagged1；二抗分別TRITC標記Rabbit anti Goat IgG和FITC標記Goat anti Rabbit IgG。DAPI復染細胞核。50％緩沖甘油封片，熒光顯

7、微鏡OlympasBX51下觀察并照相。陰性對照實驗：用等量的0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟同前。 5、統(tǒng)計分析 所有的RT-PCR實驗和蛋白印跡實驗均獨立重復三次，所得數據的值用均數(means)±標準偏差(SD)來表示。用SPSS 11.5軟件對所得數據進行單因素方差分析，當P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、5-FU誘導損傷修復過程中ABCG2、CK19和PCNA的表達變化

8、 正常氣管上皮幾乎沒有ABCG2表達，去除5-FU作用后0h，ABCG2少量表達，隨后表達量逐漸增高，至6h達到峰值，隨后逐漸降低，至48h幾乎恢復正常水平；正常氣管上皮CK19高表達，去除5-FU作用后0h，CK19表達極微量，之后表達逐漸增加，至12h后CK19表達量迅速上升，至48h幾乎恢復正常水平；正常氣管上皮PCNA微量表達，去除5-FU作用后0h表達量仍然很低。3h后PCNA開始表達并逐漸增高，至6h達到峰值，隨后下降，

9、至48h時，基本恢復正常水平。 2、Notch信號分子在大鼠氣管上皮的表達 RT-PCR結果顯示，正常大鼠氣管上皮中Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2均有表達；Notch-2、Jagged-2、Hes3和Hes5在正常氣管上皮及去除5-FU作用后氣管干細胞增殖分化過程中均沒有明顯表達。Notch-3、Jagged-1和Hey1在5-FU打擊修復過程中表達量有顯著差異。

10、3、5-FU誘導損傷修復過程中N3ICD，Jagged1及Hey1的表達變化 蛋白印跡檢測大鼠氣管上皮損傷修復過程中N3ICD，Jagged1及Hey1的蛋白水平發(fā)現，正常氣管上皮N3ICD、Jagged-1和Hey1僅有微量表達。5-FU打擊后Oh，其表達增高，并隨著氣管上皮的修復逐漸增加，分別在6h、6h和12h達到高峰，隨后逐漸降低，至48-72h降至正常水平。 4、間接免疫熒光檢測5-FU作用后大鼠氣管上皮和Ja

11、gged1、Notch3、ABCG2和CK19的表達 Jagged1為膜表達，多表達于上皮基底側。打擊后Oh，氣管上皮可見少量Jagged1陽性細胞，隨氣管上皮的修復逐漸增多，至6h Jagged1陽性細胞最多，隨后Jagged1蛋白表達逐漸減少，至48h，接近恢復正常水平。正常氣管上皮Notch3絕大部分為膜陽性，5-FU打擊后Oh，Notch3核陽性細胞增多，至6h達到高峰，隨后降低，至48h僅見極少的核陽性細胞。大部分Ja

12、gged-1陽性細胞與Notch3核陽性細胞相鄰，并分布與氣管上皮的相似區(qū)域。ABCG2和CK19均為膜表達，表達于氣管上皮不同的細胞，變化規(guī)律與Western blot結果一致，絕大部分ABCG2陽性細胞為Notch3核陽性細胞。 5、DAPT阻斷和Jag-1持續(xù)激活Notch信號通路對大鼠氣管上皮損傷修復的影響 免疫印跡結果顯示，DAPT處理后6小時Notch通路活性明顯低于對照組，24h時Notch通路幾乎完全失活

13、。DAPT阻斷后，ABCG2增高幅度下降，并于6h后顯著低于對照組；K19表達持續(xù)增高，并于6h后顯著高于對照組，至24h時基本達到正常水平，并持續(xù)高表達；PCNA增高幅度下降，6h后顯著低于對照組，至24h時已幾乎檢測不多PCNA的表達。Jag-1持續(xù)激活Notch通路，ABCG2增高幅度升高，并于6h后顯著高于對照組；CK19表達降低，并于6h后顯著低于對照組；PCNA增高幅度上升， 6h后顯著高于對照組。 HE染色顯示，

14、5-FU誘導損傷后，用DAPT阻斷Notch通路，與單純5-FU作用的對照組相比，氣管上皮的形態(tài)于6h開始出現差異。此時，大部分氣管上皮細 胞已呈立方狀；12h，可見纖毛出現在氣管上皮；12h-48h細胞沒有明顯增加，氣管上皮呈單層立法上皮，被覆纖毛。用Jag-1持續(xù)激活Ntoch通路的情況下，細胞增加迅速，但始終未見纖毛出現，48h后，氣管上皮沒有恢復假覆層纖毛柱狀上皮的結構。 6、DAPT及Jag-1預處理對大鼠氣管

15、上皮損傷修復的影響 正常氣管上皮經DAPT預處理后，細胞數量明顯減少。再經5-FU作用后，氣管上皮細胞幾乎全部脫落，沒有細胞殘留。經48h后，氣管上皮仍沒有修復的跡象。正常大鼠氣管上皮經Jag-1預處理后，纖毛細胞明顯減少。再經5-FU作用后，氣管基底膜上殘留細胞數量增加，并于24h時基本恢復了假覆層纖毛柱狀上皮的結構。 免疫熒光顯示，正常氣管上皮ABCG2(+)細胞數量稀少；經DAPT預處理后，氣管上皮未見ABCG2陽

16、性細胞。經Jag-1預處理后，氣管上皮ABCG2陽性細胞數量增加。 結論： 1、5-FU作用后48h，氣管上皮形態(tài)及增殖分化狀態(tài)基本恢復正常水平； 2、Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes21、Hey1和Hey2可能參與了正常大鼠氣管上皮穩(wěn)態(tài)的維持； 3、Notch-3、Jagged-1和Hey1可能在氣管干細胞增殖分化的過程中發(fā)揮了作用； 4、Notch信號對氣管干細胞未分化