應(yīng)力條件下成肌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控及其分子機(jī)制的探討.pdf

1、口腔頜面部的畸形嚴(yán)重影響患者的身心健康和家庭幸福,功能矯治成為重要的治療手段。面頜部肌肉組織的適應(yīng)性變化在牙頜面畸形的矯治中扮演著重要角色。探討矯形力對(duì)肌肉細(xì)胞的增殖、分化、凋亡的具體影響和分子機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)矯形治療的分子機(jī)制以及合理利用矯形力提高臨床預(yù)后具有重要意義。既往研究表明,應(yīng)力條件下ROS生成顯著增加,而JNK、NFkappaB也具有不同程度的活化,提示它們之間可能存在一定的聯(lián)系。而它們之間如何交互對(duì)話以及如何影響細(xì)胞的命

2、運(yùn)尚不清楚。本研究旨在闡明機(jī)械牽張力條件下,ROS是調(diào)節(jié)JNK和NFkappaB這兩條信號(hào)通路間的交互作用的分子機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞功能的具體影響。
　　【目的】本研究旨在探索不同應(yīng)力條件下ROS的動(dòng)態(tài)變化,他們?nèi)绾斡绊懗杉〖?xì)胞的增殖、分化和凋亡,NFkappaB和JNK在該過程中的作用;從而獲得應(yīng)力調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)信息,為正畸治療中合理使用應(yīng)力引起肌肉改建提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　【方法與結(jié)果】(1)不同幅度的周期性應(yīng)力對(duì)成肌

3、細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響不同。本課題首先通過MTT和DNA Ladder實(shí)驗(yàn)測定在受到不同大小的牽張應(yīng)力作用下(0％,5％,10％,15％,20％/10 cycles/ min)的C2C12細(xì)胞的增殖和凋亡的改變,通過檢測細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)改變,分析應(yīng)力條件下細(xì)胞分化狀態(tài)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn),5％的周期性應(yīng)力可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖,同時(shí)抑制分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)的細(xì)胞分化相關(guān)基因myogenin等的表達(dá)。當(dāng)牽張應(yīng)力大于10％后,可以觀察到明顯的D

4、NA斷裂。除此以外,我們還發(fā)現(xiàn)牽張應(yīng)力大于10％后,細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)大量的PARP剪切產(chǎn)物,隨應(yīng)力的增加而增多。當(dāng)周期性牽張應(yīng)力超過15％10cycles/min時(shí),整體存活細(xì)胞數(shù)明顯降低。由此可見,高強(qiáng)度牽拉介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,參與整體細(xì)胞數(shù)的減少,可能不利于組織的重塑和再生。(2)周期性應(yīng)力對(duì)ROS的產(chǎn)生、NFkappaB活性、JNK1活化的影響。我們通過熒光染料檢測ROS的生成,熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測NFkappaB的活性以及Western

5、Blot檢測磷酸化和總體JNK1的水平;分析不同應(yīng)力條件下細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量、JNK和NFkappaB的活化程度以及它們間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著周期性應(yīng)力的增加,細(xì)胞內(nèi)ROS生成逐漸增加。隨著應(yīng)力的增大,細(xì)胞的凋亡逐漸增加,與此同時(shí),JNK1活性逐漸增高,而JNK1表達(dá)水平并沒有明顯改變。與ROS生成量和JNK1活化逐漸增加不同,應(yīng)力在10％以下時(shí)NFkappaB的活性隨著應(yīng)力的增大而增大,而當(dāng)應(yīng)力大于15％時(shí),NFkappaB活性開

6、始下降。為了闡明ROS和JNK活性二者之間的關(guān)系,我們提前4小時(shí)對(duì)細(xì)胞使用不同濃度的ROS清除劑NAC,然后對(duì)細(xì)胞施加20％/10cycles/min的牽張應(yīng)力24小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ROS的產(chǎn)生被NAC抑制。當(dāng)NAC的濃度達(dá)到100μM時(shí),ROS降至基線水平。10μM NAC開始抑制JNK的活性,隨著NAC的濃度的增加,JNK活性逐漸降低。10μM NAC處理后增加NFkappaB的活性。NAC濃度的繼續(xù)增加,NFkappaB的活性先升高

7、后降低,當(dāng)NAC升高至1000μM時(shí),NFkappaB的活性降至基線以下水平。所有這些結(jié)果提示,當(dāng)ROS的量積累到一定的時(shí)候,JNK開始激活,而ROS的量較低的時(shí)候,NFkappaB被激活。(3)低強(qiáng)度應(yīng)力條件下NFkappaB的活化,促進(jìn)miR146a的表達(dá),后者抑制細(xì)胞分化。鑒于低強(qiáng)度條件下,NFkappaB活化,細(xì)胞增殖增加而分化受阻。我們分析了該條件下,NFkappaB的重要下游靶分子miR146a的表達(dá)及其在過程中的作用。采用

8、miRNA特異性qRT-PCR我們發(fā)現(xiàn),低強(qiáng)度應(yīng)力條件下,miR146a表達(dá)增加,過表達(dá)miR146a可以抑制細(xì)胞的分化,抑制miR146a的功能可以促進(jìn)細(xì)胞的分化。借助生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn),分化重要的調(diào)節(jié)基因Numb是miR146a的靶分子,而過表達(dá)miR146a可以觀察到Numb的表達(dá)降低。Numb的3’UTR報(bào)告系統(tǒng),顯示miR146a可以抑制Numb的3’UTR的活性。(4)高強(qiáng)度應(yīng)力條件下,ROS大量產(chǎn)生,JNK1的激活抑制NFka

9、ppaB的活化。在較強(qiáng)的應(yīng)力作用下,NFkappaB和JNK的活性變化呈現(xiàn)相反的關(guān)系,提示JNK的活性可能引起了NFkappaB活性的降低。因此,我們使用JNK的抑制劑預(yù)先處理細(xì)胞或者JNK的特異性RNAi24小時(shí)后施加20％的周期性的牽張力24小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,抑制JNK信號(hào)會(huì)增加NFkappaB的活性,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的存活。為了明確NFkappaB活性的抑制是否對(duì)JNK激活引起的細(xì)胞凋亡起關(guān)鍵作用,我們在JNK被抑制的情況

10、下進(jìn)一步利用NFkappaB的阻斷劑aspirin。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單純使用JNK抑制劑組相比,聯(lián)合使用JNK和NFkappaB的抑制劑顯著降低高強(qiáng)度應(yīng)力條件下細(xì)胞活力,說明在高強(qiáng)度應(yīng)力條件下,JNK活化通過抑制NFkappaB引起細(xì)胞凋亡。(5)高強(qiáng)度應(yīng)力條件下,JNK的激活阻斷了NFkappaB的核轉(zhuǎn)位和Bcl2的轉(zhuǎn)錄。為研究JNK1抑制NFkappaB的活化的詳細(xì)機(jī)制和下游效應(yīng),我們進(jìn)一步通過分離胞漿胞核,分析NFkappaB的核定位

11、及RT-PCR分析其下游促進(jìn)細(xì)胞存活分子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),20％牽張應(yīng)力條件下,細(xì)胞核內(nèi)幾乎檢測不到的p65定位。不僅如此,20％的牽張應(yīng)力條件下NFkappaB的下游抗凋亡靶基因Bcl2幾乎不表達(dá);阻斷JNK的活性引起細(xì)胞核中的NFkappaB水平升高,Bcl2的表達(dá)也得以恢復(fù)。不僅如此,我們還觀察到,JNK抑制劑的功能強(qiáng)于JNK1 siRNA,提示該過程中JNK的其他亞型也可能參與其中。
　　【結(jié)論】低強(qiáng)度的應(yīng)力,促進(jìn)細(xì)胞的增