mir-374b和miR-299對成肌細胞分化的作用及其分子機制.pdf

1、骨骼肌的形成是一個復雜的過程，包括成肌細胞的增殖、分化和肌管的形成等，這一過程受到一系列的信號分子，如轉錄因子等的調節(jié)。microRNA(miRNA)是動植物中廣泛存在的、物種間高度保守的、長度為22個核苷酸左右的一類單鏈小分子非編碼的RNA，在轉錄或轉錄后水平調控基因的表達。近年來，隨著對microRNA研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)這類單鏈小分子RNA參與了骨骼肌發(fā)育的調節(jié)。Myf6是生肌調節(jié)因子MRFs（Myogenic Regulator

2、y Factors）家族的一員，它可以識別并結合于許多肌肉發(fā)育相關基因的啟動子區(qū)域，調控肌肉的發(fā)育。本研究鑒定了直接靶定Myf63'UTR的microRNAs，主要研究了miR-374b和miR-299對C2C12成肌細胞分化的影響，主要工作及結果如下:
　　1.調節(jié)Myf6基因的microRNA鑒定
　　通過在線軟件預測了miR-299、miR-374b、miR-376c、miR-377、miR-499和miR-669f是

3、直接靶定Myf6基因的候選microRNAs。我們構建了482bp的包含有候選microRNAs結合位點的My f63'UTR野生型和突變掉miR-299和miR-374b結合位點的Myf63'UTR突變型雙熒光素酶報告載體。證明了miR-374b能夠直接靶定Myf63'UTR并調控內源Myf6表達。
　　2.miR-374b在肌細胞分化中的作用
　　利用Q-PCR分別分析了miR-374b的組織表達譜和miR-374b在成

4、肌細胞分化過程中的表達模式。miR-374b在2月齡C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、脂肪、骨骼肌九個組織廣泛表達;miR-374b在C2C12成肌細胞分化的第0h、24h、72h和96h呈先上升后下降的表達趨勢。
　　我們通過超表達和抑制內源miR-374b表達，研究了miR-374b在C2C12成肌細胞分化過程中的作用。結果顯示，在超表達miR-374b后，分化標志基因MyoG的表達量增加，而MyoD和Myf5基因

5、的mRNA水平變化不明顯。但western blot檢測發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈(MyHC)的蛋白水平明顯降低，免疫熒光檢測也顯示細胞融合率下降;相反，轉染miR-374b的抑制劑，抑制miR-374b的表達，肌球蛋白重鏈的蛋白水平明顯升高，免疫熒光檢測顯示細胞融合率上升。因此，我們證實了miR-374b負向調控C2C12成肌細胞的分化。另外，細胞增殖實驗顯示miR-374b促進C2C12成肌細胞的增殖。
　　miR-374b在腓腸肌（混

6、合型肌纖維）中的表達量高于比目魚?。±w維）的表達量。在超表達miR-374b的C2C12細胞中，Myh7（慢?。┖蚆yh4（快?。┑谋磉_量均有下降，但是Myh7的下降幅度要大于Myh4的下降幅度，說明miR-374b可以同時抑制快肌纖維和慢肌纖維的形成，但是對慢肌的抑制作用更加明顯。
　　3.miR-299在肌細胞分化中的作用
　　同樣，我們利用Q-PCR分別分析了miR-299組織表達譜以及miR-299在成肌細胞分化

7、過程中的表達模式。在2月齡C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、脂肪、骨骼肌九個組織中，miR-299廣泛表達;miR-299在C2C12成肌細胞分化的第0h、24h、72h和96h，表達量呈上升趨勢。
　　通過超表達和抑制內源miR-299表達實驗，我們研究了miR-299在C2C12成肌細胞分化過程中的作用。結果顯示，超表達miR-299后，分化標志基因MyoG，MyoD，My f5的mRNA水平均上升;通過轉染miR