脂多糖通過(guò)PGE2-EP2信號(hào)途徑介導(dǎo)肺血管生成并促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著腫瘤發(fā)病率和死亡率的逐年升高，惡性腫瘤已成為威脅人類健康最主要的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年美國(guó)將有1，665，540例新發(fā)癌癥患者，其中585，720例將死于惡性腫瘤。在美國(guó)女性中，乳腺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的第一位，死亡率居惡性腫瘤第二位。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征，是臨床上大多數(shù)腫瘤患者治療失敗和致死的最主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過(guò)程，它受到腫瘤本身和宿主環(huán)境等多因素的影響。1

2、889年，Paget率先提出了“種子和土壤”學(xué)說(shuō)，即癌細(xì)胞（種子）需要適當(dāng)?shù)奈h(huán)境（土壤）生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，他認(rèn)為腫瘤微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中具有重要作用。炎癥是目前已證實(shí)的能通過(guò)細(xì)胞因子、趨化因子、活化氧等調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞活性來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的環(huán)境因素。近年來(lái)，隨著對(duì)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入研究，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到炎性微環(huán)境在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，炎癥與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系成為人們研究的熱點(diǎn)之一，但其機(jī)制目前仍不清楚。本研究通過(guò)建立炎癥動(dòng)物模型

3、、乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型及體外實(shí)驗(yàn)等研究，旨在探討炎癥在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及可能的機(jī)制。
　　研究方法：
　　將50只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組:
　?、貾BS組:腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS);
　　②LPS組:腹腔注射脂多糖(LPS);
　?、跴T組:腹腔注射PBS+尾靜脈注射4T1細(xì)胞;
　?、躄T組:腹腔注射LPS+尾靜脈注射4T1細(xì)胞;
　　⑤LTC組:腹腔注射LPS+尾靜脈注射

4、4T1細(xì)胞+腹腔注射塞來(lái)昔布(Celecoxib，Cele)。
　　其中，PBS組和LPS組:連續(xù)3天腹腔注射PBS或LPS（5mg/Kg/d），第4天處死小鼠收集標(biāo)本;PT組、LT組及LTC組:PT組連續(xù)3天腹腔注射PBS，LT組和LTC組連續(xù)3天腹腔注射LPS，三組小鼠均于第3天腹腔注射PBS/LPS后4小時(shí)給予尾靜脈注射乳腺癌4T1細(xì)胞1×105/只，第4天起PT組、LT組給予腹腔注射PBS，LTC組給予腹腔注射塞來(lái)昔布5m

5、g/kg/d治療，4周后處死小鼠。所有小鼠眼球取血法收集血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、前列腺素E2(PGE2)水平，收集肺組織做病理染色，采用免疫熒光CD31染色比較小鼠肺組織血管的變化，PT組、LT組及LTC組觀察肺轉(zhuǎn)移瘤并計(jì)數(shù)。提取各組小鼠肺組織蛋白，檢測(cè)VEGF、環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)水平。體外，4T1細(xì)胞給予不同濃度LPS刺激24小時(shí)后，使用四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)方法檢測(cè)細(xì)

6、胞增殖能力。分離正常小鼠的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(MPVEC)并培養(yǎng)，使用VEGF、PGE2、Cele刺激Matrigel基質(zhì)膠上培養(yǎng)的MPVEC，觀察內(nèi)皮細(xì)胞血管生成情況。給予PGE2、PGE2受體激動(dòng)劑、PGE2受體拮抗劑刺激MPVEC后，ELISA方法檢測(cè)MPVEC培養(yǎng)上清液中VEGF表達(dá)水平，使用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)來(lái)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行

7、統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.LPS誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)
　　LPS組小鼠第2天開(kāi)始精神萎靡，雙眼發(fā)紅，毛發(fā)蓬亂，逐漸消瘦;PBS組小鼠反應(yīng)敏捷，毛發(fā)光亮。LPS組小鼠肺臟體積較PBS組大，明顯水腫、充血，肺組織蘇木精-伊紅染色（HE染色）顯示LPS小鼠肺泡壁中斷，肺泡腔可見(jiàn)炎性滲出，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張。
　　2.LPS促進(jìn)肺血管生成
　　小鼠肺血管生成情況

8、使用CD31免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示LPS組小鼠的肺血管走行迂曲、紊亂，血管叢較密集、扭曲，管腔之間相互交通，PBS組小鼠肺血管規(guī)則、有序，LPS組小鼠肺血管密度明顯大于PBS組。LTC組小鼠給予腹腔注射塞來(lái)昔布(5mg/kg/d)治療，肺組織中CD31陽(yáng)性細(xì)胞較未治療組（LT組）小鼠明顯減少，血管叢規(guī)則、有序，密度減小。
　　3.LPS促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移
　　HE染色顯示，LT組小鼠肺組織轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和浸潤(rùn)區(qū)域均明顯

9、大于PT組。顯微鏡下計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤，LT組小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目平均為(37.5±4.3)個(gè)，明顯大于PT組(12.1+3.5)個(gè)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。LTC組小鼠給予塞來(lái)昔布治療后，肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目較未治療組（LT組）明顯較少，腫瘤浸潤(rùn)區(qū)域小于LT組。
　　4.LPS對(duì)4T1細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響
　　不同濃度的LPS(0ug/ml、10ug/ml、100ug/ml)刺激4T1細(xì)胞24小時(shí)后，使用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞

10、增殖能力。結(jié)果顯示，LPS刺激對(duì)4T1細(xì)胞增值能力的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.LPS促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生
　　不同濃度的PGE2(10nM、100nM、200nM)刺激MPVECs24小時(shí)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞蛋白中VEGF水平隨PGE2刺激濃度增加而升高。各組小鼠血清中的VEGF、PGE2水平使用ELISA方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，LPS組小鼠血清中VEGF、PGE2水平明顯高于PBS組，LT組小鼠血清中PGE

11、2和VEGF水平均明顯高于PT組，而塞來(lái)昔布治療的LTC組小鼠血清中生長(zhǎng)因子水平均較未治療組(LT組)明顯下降。
　　6.Celecoxib處理MPVECs抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成
　　體外血管生成實(shí)驗(yàn)顯示，單獨(dú)使用Celecoxib處理MPVECs，內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠上形成的管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目較對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）減少;單獨(dú)使用PGE2、VEGF刺激MPVECs后，內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔樣結(jié)構(gòu)生成增多。內(nèi)皮細(xì)胞中

12、先加入PGE2/VEGF，再加入Celecoxib，則PGE2、VEGF盼促血管生成作用受到抑制。
　　7.LPS通過(guò)PGE2-EP2通路促進(jìn)VEGF產(chǎn)生
　　PGE2的4種特異性EP受體激動(dòng)劑處理內(nèi)皮細(xì)胞后，EP2受體激動(dòng)劑能使上清液中VEGF水平升高，而EP1、EP3、EP4受體激動(dòng)劑對(duì)VEGF水平無(wú)明顯影響。EP2受體拮抗劑能使MPVEC培養(yǎng)上清液中VEGF水平下降。
　　結(jié)論：
　　1.LPS誘導(dǎo)VEGF