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文檔簡介
1、目的:急性早幼粒細(xì)胞白血病是急性髓細(xì)胞白血病的一個亞型,APL出現(xiàn)特異的染色體和基因改變,這是APL發(fā)病及應(yīng)用全反式維甲酸和亞砷酸治療有效的分子基礎(chǔ),其療效已得到國內(nèi)外的公認(rèn)。
研究采用ATRA、As2O3作用于人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞,通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT法觀察細(xì)胞生長抑制狀況、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞分化及凋亡、并應(yīng)用RQ-PCR法檢測ATRA、As2O3作用前后NB4細(xì)胞CD44v3、CD44v6及CD44v
2、10及PML/RARα mRNA表達(dá)水平的變化。旨在探討誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化或凋亡過程中不同CD44v分子和PML/RARα表達(dá)的變化,及二者的相互關(guān)系,為CD44v作為白血病診斷、療效判斷及預(yù)后指標(biāo)提供理論依據(jù)。
方法:體外培養(yǎng)人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞,分別用ATRA、As2O3、ATRA+As2O3進(jìn)行干預(yù),應(yīng)用MTT比色法檢測細(xì)胞生長;用流式細(xì)胞術(shù)分析以上藥物對細(xì)胞分化的影響;AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測
3、上述藥物對NB4細(xì)胞凋亡的影響;應(yīng)用RQ-PCR法檢測細(xì)胞中PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達(dá)水平變化。所得結(jié)果運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理。
結(jié)果:1.ATRA、As2O3作用下NB4細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變:NB4細(xì)胞株具有急性早幼粒白血病細(xì)胞的典型形態(tài),胞漿充滿顆粒,核膜略凹陷,有空泡。Wright’s-Giemsa染色光鏡下觀察:經(jīng)ATRA作用后NB4細(xì)胞體積變小、核漿比例縮
4、小、染色質(zhì)變粗糙、核仁消失;核形態(tài)不規(guī)則,呈腎形、桿狀及分葉核。As2O3作用于NB4細(xì)胞后表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞膜完整,胞漿中出現(xiàn)空泡,核染色質(zhì)濃縮、碎裂成塊彌散在胞漿中,并可見膜結(jié)構(gòu)包裹的凋亡小體。
2.ATRA、As2O3對NB4細(xì)胞的增殖抑制作用:統(tǒng)計學(xué)分析顯示,ATRA、As2O3及二者聯(lián)用對NB4細(xì)胞均有增殖抑制作用,隨時間延長,生長抑制率明顯增加,各個時間點間比較,除ATRA組24h與48h之間無統(tǒng)計學(xué)差異
5、之外,其他時間點間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;同一時間點,各個處理組之間比較,24h各處理組之間無統(tǒng)計學(xué)差異,48h與96h各處理組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異,生長抑制率As2O3+ATRA組大于As2O3組,大于ATRA組;72h As2O3+ATRA大于As2O3組和ATRA組,而As2O3組和ATRA組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
3.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細(xì)胞表面CD11b抗原表達(dá)的影響:ATRA作用于NB4細(xì)胞
6、48h、72h、96h后,CD11b抗原表達(dá)分別為(32.47±2.95)[%]、(84.93±1.45)[%]、(90.9±0.35)[%];As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表達(dá)分別為(10.97±1.33)[%]、(15.7±0.87)[%]、(18.9±0.30)[%];ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后,CD11b抗原表達(dá)分別為(18.57±0.65)[%]、(21.1
7、7±0.65)[%]、(26.53±0.83)[%]。統(tǒng)計學(xué)分析顯示:各個處理組隨時間延長,CD11b表達(dá)逐漸增多,各個時間點之間有顯著性差異;同一時間點,各處理組間比較,CD11b的表達(dá)ATRA組大于ATRA+As2O3組,大于As2O3組,均高于空白對照組,有統(tǒng)計學(xué)差異。
4.As2O3、ATRA+As2O3對NB4細(xì)胞凋亡的影響:ATRA作用于NB4細(xì)胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(0.57±0.
8、06)[%]、(0.90±0.20)[%]、(1.07±0.35)[%]、(1.20±0.30)[%];As2O3作用于NB4細(xì)胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(9.53±0.59)[%]、(13.77±0.70)[%]、(18.27±0.35)[%]、(16.23±1.15)[%];ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(2.27±0.32)[%]、(3.93±0.25)
9、[%]、(7.83±0.40)[%]、(9.00±0.75)[%]。經(jīng)單因素方差分析,在對照組中4個時間點測得的早期、中晚期和總凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異,說明自然凋亡對本實驗研究的其他統(tǒng)計結(jié)果沒有影響。各個時間點ATRA組與對照組早期凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異,24h~72h ATRA組與對照組中晚期凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異,96h差異有統(tǒng)計學(xué)意義。As2O3作用24h細(xì)胞早期凋亡率較高,而在As2O3作用48h以后細(xì)胞以中晚期凋亡為主。24h、48h、7
10、2h As2O3處理的NB4細(xì)胞隨時間延長,早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均明顯增高,呈時間依賴性,96h較72h早期凋亡率降低,總凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異。各個時間點As2O3組凋亡率均高于其他各組,有統(tǒng)計學(xué)差異。
5.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細(xì)胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表達(dá)水平的影響:RQ-PCR檢測結(jié)果顯示,以各組各指標(biāo)空白對照組RQ值為1,ATR
11、A作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為:0.4867±0.0040、0.2380±0.0056、0.2137±0.0061;CD44v3的RQ值分別為:0.6437±0.0042、0.6263±0.0047、0.4020±0.0030;CD44v6的RQ值分別為:0.8370±0.0040、0.5417±0.0040、0.4263±0.0051;CD44v10的RQ值分別為:0.4940±0.0026、
12、0.3780±0.0030、0.2643±0.0067;As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為:0.3180±0.0027、0.3030±0.0040、0.2863±0.0047;CD44v3的RQ值分別為:0.6527±0.0045、0.4957±0.0057、0.2223±0.0035;CD44v6的RQ值分別為:0.5817±0.0047、0.5343±0.0042、0.4617±0.00
13、38;CD44v10的RQ值分別為:0.5263±0.0045、0.2490±0.0036、0.3347±0.0040;ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為:0.6983±0.0025、0.2717±0.0035、0.1910±0.0036;CD44v3的RQ值分別為:0.4543±0.0047、0.4127±0.0040、0.1980±0.0070;CD44v6的RQ值分別為:0.
14、5027±0.0040、0.3230±0.0020、0.2787±0.0020;CD44v10的RQ值分別為:0.4657±0.0035、0.4260±0.0598、0.1487±0.0035;統(tǒng)計學(xué)分析顯示:除ATRA+As2O3組48h與72h之間CD44v10的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異外,各處理組隨時間延長上述各指標(biāo)的表達(dá)均呈遞減趨勢,且各時間點之間有統(tǒng)計學(xué)差異。同一時間點,不同處理組之間上述各個指標(biāo)下降趨勢經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得出:除72h經(jīng)A
15、TRA和ATRA+As2O3作用前后CD44v10的變化無統(tǒng)計學(xué)差異外,其他各組均可得出各個時間點的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達(dá)經(jīng)ATRA+As2O3作用后下降最明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)繪制散點圖并應(yīng)用直線相關(guān)分析得出:經(jīng)ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用前后,隨時間延長,PML/RARα與CD44v6的變化趨勢均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.98、r=0.951、r=0.9
16、99;As2O3作用前后,隨時間延長,PML/RARα與CD44v3的變化趨勢呈正相關(guān),r=0.965,其他各組之間無直線相關(guān)關(guān)系。
結(jié)論:1.ATRA、As2O3及二者聯(lián)用對NB4細(xì)胞具有增殖抑制作用,隨時間延長,生長抑制率明顯增加;同一時間點,各個處理組之間比較,48h、72h和96h As2O3+ATRA組生長抑制率均高于As2O3組和ATRA組。
2.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可誘導(dǎo)N
17、B4細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)增加,且隨作用時間延長表達(dá)逐漸增加;同一時間點,各處理組間比較,ATRA組處理的NB4細(xì)胞CD11b的表達(dá)明顯高于ATRA+As2O3組和As2O3組。
3.As2O3、ATRA+As2O3可誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡。隨時間延長,凋亡細(xì)胞數(shù)增多,呈時間依賴性。As2O3作用24h細(xì)胞早期凋亡率較高,48h以后細(xì)胞以中晚期凋亡為主。各個時間點不同處理組之間As2O3處理的NB4細(xì)胞早期凋亡率、中晚期凋亡
18、率及總凋亡率均明顯高于其他各組。
4.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可使NB4細(xì)胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達(dá)下降,呈時間依賴性。ATRA+As2O3作用于NB4細(xì)胞后各時間點的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達(dá)下降明顯高于其他處理組。經(jīng)ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用后,隨時間延長,PML/RARα與CD44
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