月季花組織特異單向嵌合啟動(dòng)子的構(gòu)建及活性分析.pdf

1、為獲得月季新異花色，有效調(diào)控花色素代謝途徑，需要在月季轉(zhuǎn)基因研究中，首先選擇高效的組織特異性的啟動(dòng)子，以提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)效率。同時(shí)為了使后續(xù)轉(zhuǎn)基因研究的更為深入，使外源基因在植物受體中表達(dá)調(diào)控的更為精準(zhǔn)，應(yīng)當(dāng)盡量避免重復(fù)使用相同序列的啟動(dòng)子片段以減小造成基因沉默的風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在克隆得到月季花組織特異性的啟動(dòng)子，使其驅(qū)動(dòng)外源基因在月季花組織中高效的表達(dá)，通過對(duì)其進(jìn)行嵌合增強(qiáng)子的改造，為多基因表達(dá)載體的構(gòu)建提供有效的調(diào)控元

2、件，以期達(dá)到增強(qiáng)組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)活性的目的。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　1．月季花快速繁殖體系的建立
　　以“卡羅拉”月季當(dāng)年生枝條中段（半木質(zhì)化）的帶芽莖段為外植體，采用MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA及6-BA的不同激素組合進(jìn)行萌發(fā)、增殖及生根培養(yǎng)。通過馴化煉苗，在5-6個(gè)月內(nèi)獲得健壯的月季快繁植株?！翱_拉”腋芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，萌發(fā)率為96.67％；叢生芽增

3、殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.05mg·L-1，增值系數(shù)為3.36；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.5mg·L-1，生根率可達(dá)100%；通過馴化煉苗，盆栽定植的成活率可達(dá)90％以上。
　　2.基因槍法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化月季花瓣的體系優(yōu)化
　　以“雪山”月季花瓣為受體材料，通過對(duì)GUS報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，確定了合適轉(zhuǎn)化月季花瓣材料的基因槍轟擊條件技術(shù)參數(shù)，建立了穩(wěn)定高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。通過試驗(yàn)確定了在

4、相同質(zhì)粒pCAMBIA1305.1用量0.5μg/槍時(shí)的最佳技術(shù)參數(shù)是轟擊壓強(qiáng)為1150psi、轟擊距離為9cm。
　　3.月季花特異嵌合啟動(dòng)子的構(gòu)建及對(duì)照啟動(dòng)子片段的克隆
　　通過Genebank中已登錄的月季查爾酮合成酶CHS基因序列，利用染色體步移法擴(kuò)增得到CHS基因上游1.3kb的調(diào)控序列，通過分析啟動(dòng)子的核心調(diào)控元件，克隆包含啟動(dòng)子核心區(qū)域RCHS在內(nèi)的大小為275bp、720bp、1357bp的三組啟動(dòng)子序列作為

5、對(duì)照，同時(shí)將異源增強(qiáng)子片段OCSenhancer、翻譯增強(qiáng)子Ω元件與CHS花特異啟動(dòng)子RCHS核心片段進(jìn)行融合，設(shè)計(jì)合成530bp的單向嵌合啟動(dòng)子序列。
　　4.單向嵌合啟動(dòng)子及對(duì)照啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá)分析
　　將單向嵌合啟動(dòng)子pOCSenhancer-RCHS-Ω及三組對(duì)照啟動(dòng)子片段R1CHS、R2CHS及RCHS分別替換pCAMBIA1305.1空載中的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建C

6、HS啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，并根據(jù)優(yōu)化的基因槍技術(shù)參數(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化月季花瓣，通過GUS組織化學(xué)染色的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因花瓣進(jìn)行GUS活性檢測(cè)。
　　結(jié)果表明，275bp的啟動(dòng)子核心片段是驅(qū)動(dòng)GUS基因在花瓣中特異性表達(dá)的必要序列，核心區(qū)域上游調(diào)控序列的延長對(duì)于增強(qiáng)GUS基因表達(dá)的活性沒有顯著的影響，但融合增強(qiáng)子序列后的單向嵌合啟動(dòng)子對(duì)驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)水平有明顯的提高。以上研究結(jié)果驗(yàn)證了月季CHS啟動(dòng)子是花組織特異性表達(dá)