HPV16介導(dǎo)HIF-1α上調(diào)肺癌細(xì)胞Glut1表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、前言：
　　HPV16 E6/E7調(diào)控Glut1表達(dá)的具體機(jī)制不清。我們發(fā)現(xiàn)肺癌及癌前期病變細(xì)胞中HPV16 E6/E7、HIF-1α及Glut1表達(dá)增高，并且HPV16 E6/E7與HIF-1α和Glut1呈正相關(guān)。已有報(bào)道HPV16E6或E7可上調(diào)HIF-1α的活性，另有報(bào)道HIF-1α可上調(diào)Glut1的mRNA和蛋白表達(dá)，但HPV-16 E6/E7是否可介導(dǎo)HIF-1α上調(diào)Glut1的表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)更多的葡萄糖來(lái)滿足癌細(xì)胞的

2、高代謝率和增長(zhǎng)速度現(xiàn)在還不清楚。為此我們擬用p-EGFP-N1-HPV16 E6/E6mut、p-EGFP-N1-HPV16 E7/E7mut及p-EGFP-N1質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，檢測(cè)E6、E7、HIF-1α、Glut1的蛋白和mRNA表達(dá);siRNA沉默HPV16E6后，檢查HIF-1α及Glut1的表達(dá)變化，明確HPV-16上調(diào)Glut1表達(dá)的具體機(jī)制。
　　材料與方法：
　　一、材料
　?。ㄒ唬┡R床資料<

3、br>　　收集2011年1月至2012年7月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及病房胸水標(biāo)本150例，其中肺腺癌92例，肺鱗癌3例，炎癥35例，結(jié)核20例。
　　（二）細(xì)胞系
　　肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（人肺腺癌系）、H1299（人肺腺癌系）、NCI-H460（人大細(xì)胞肺癌系）均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞生物所，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行傳代。LK2（人肺鱗癌細(xì)胞系）購(gòu)自上海中科院細(xì)胞生物所，用含10％小牛血清的DMEM

4、培養(yǎng)液進(jìn)行傳代。血清、RPMI-1640培養(yǎng)液及DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司。
　?。ㄈ?shí)驗(yàn)用品
　　1、主要試劑
　　HPV16E7兔抗人多克隆抗體、Glut1山羊抗人多克隆抗體、HIF-1a兔抗人多克隆抗體及HPV16E6兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物公司，DAB酶底物顯色試劑盒和S-P超敏試劑盒均購(gòu)自福州買(mǎi)新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，Real-timePCR引物購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，Prime

5、Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司，Lipo2000購(gòu)自上海英濰捷基，p-EGFP-N1-HPV16 E6/E6mut、p-EGFP-N1-HPV16 E7/E7mut及p-EGFP-N1質(zhì)粒均由廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所唐旭東教授惠贈(zèng)。
　　2、試驗(yàn)儀器
　　攤、烤片機(jī)(LS-90) 沈陽(yáng)龍首電子儀器公司

6、；
　　冰箱 青島海爾股份有限公司；
　　恒溫箱 沈陽(yáng)醫(yī)療器械廠；
　　電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；
　　免疫組化保濕盒 福州邁新生物技術(shù)有限公司；
　　醫(yī)學(xué)圖像采集分析系統(tǒng) 日本Olympus公司；
　　低溫超速離心機(jī)和低速離心機(jī)Hitachi，日本；
　　紫外分光光度計(jì)和凝膠成像系統(tǒng)UVP，英國(guó)；
　　CO2培養(yǎng)箱Heraeus，德國(guó)；
　　超凈臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備

7、；
　　ABI 7900HT儀器Applied Biosystems,USA；
　　NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Wilmington,USA)；
　　基因擴(kuò)增儀G-Storm，英國(guó)；
　　電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療；
　　超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝；
　　電泳及轉(zhuǎn)印儀Bio-Rad，美國(guó)；
　　酶標(biāo)儀Bio-Rad，美國(guó)。
　　二、方法

8、>　　1、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)
　　采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(S-P)法行抗HPV16E6(1∶200)，HPV16E7(1∶200)，Glut1(1∶100)免疫細(xì)胞化學(xué)染色。細(xì)胞塊切片，常規(guī)脫蠟至水，高溫進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗4℃孵育過(guò)夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性肺癌切片做陽(yáng)性對(duì)照。
　　2、細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率測(cè)定
　　轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按60％-70％密度接種于6孔板，

9、采用Lipofectamine TM 2000(英濰捷基，上海)轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24h測(cè)轉(zhuǎn)染效率，并終止細(xì)胞培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　3、Real-time PCR實(shí)驗(yàn)
　　利用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)合成特異性的cDNA，總反應(yīng)體系10μl（總RNA5μl），在基因擴(kuò)增儀（G-Storm，英國(guó)）內(nèi)經(jīng)過(guò)如下循環(huán)完成反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程

10、:37℃，15min;85℃，5see，4℃貯存，次日擴(kuò)增待用。Real-time PCR在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems，USA)內(nèi)完成。反應(yīng)體系20μl，包括cDNA0.25μl，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ優(yōu)化程序進(jìn)行擴(kuò)增，采用相對(duì)定量的方法，循環(huán)過(guò)程如下:95℃，30sec;95℃，15sec;60℃

11、，30sec;40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均設(shè)2次重復(fù)。用3次獨(dú)立樣本經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)用公式RQ=2-△△△Ct的方法進(jìn)行分析。
　　4、Western blot
　　收集培養(yǎng)的細(xì)胞，加入蛋白裂解液充分裂解，4℃靜置，孵育40min，4℃離心20min(12000g/min)，取上清，放入-70℃冰箱保存。用Brodford法測(cè)蛋白濃度，每孔50ug蛋白上樣量，12％SDS-PAGE凝膠電泳，4℃，40V條件過(guò)夜，

12、濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22umPVDF膜，5％脫脂奶粉封閉2h，一抗HPV16E6(1∶100),HPV16E7(1∶100),HIF-1a(1∶200),Glut1(1∶200),GAPDH(1∶1000),β-action(1∶1200)4℃過(guò)夜，37℃二抗孵育2h，化學(xué)發(fā)光，顯影，以β-actin、GAPDH為內(nèi)參，用凝膠成像分析系統(tǒng)（BioImaging Systems，美國(guó)）分析蛋白條帶灰度值，每組結(jié)果均為相同條件重復(fù)3次。

13、
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理:采用mean±SD分析各組數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用One way ANOVA，Dunnett T3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.HPV16、HIF-1α和Glut1在部分肺癌患者胸水中的表達(dá)水平明顯增高
　　2.轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)介于39.85％至47.09％。
　　3.在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HPV-

14、16 E6和E7癌蛋白增強(qiáng)HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)
　　4.在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HPV-16 E6和E7癌蛋白增強(qiáng)Glut1蛋白及mRNA的表達(dá)
　　5.LK2、A549細(xì)胞系進(jìn)行HPV16 E6-siRNA干擾后HPV16E6、HIF-1α及Glut1蛋白水平及mRNA水平表達(dá)降低
　　6.LK2、A549細(xì)胞系進(jìn)行HIF-1α-siRNA干擾后HIF-1α及Glut1蛋白水平及mRNA水平表達(dá)降低