青枯雷爾氏菌致病因子的分子特性及其調(diào)控研究.pdf

1、青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是世界十大重要植物病原物之一，因其分布范圍廣、寄主范圍大且具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性而被認為是一個多變的復(fù)合種（species complex）。目前，在我國青枯雷爾氏菌已有向高緯度高海拔冷涼地區(qū)逐漸蔓延之勢。全基因組序列的獲得為全面解釋其在寄主識別、致病力變異、環(huán)境適應(yīng)性以及群體進化等方面的特性提供了重要基礎(chǔ)。長期以來，用于防治由該菌引起的植物青枯病的措施主要包括使用化學(xué)農(nóng)藥、

2、培育抗性品種、生物防治以及農(nóng)業(yè)防治等。由于化學(xué)藥劑防治存在諸多問題，如效果不理想、污染環(huán)境等，目前有很多關(guān)于使用綠色、環(huán)保、有效的天然活性化合物來代替的報道。但是因該菌在環(huán)境中的多態(tài)性使得迄今為止仍未找到有效的防治藥劑，造成的經(jīng)濟損失慘重。此外，不同藥劑的長期使用是否會影響青枯雷爾氏菌的致病力發(fā)生變化也有待進一步研究。本論文在對代表青枯雷爾氏菌進行全基因組測序的基礎(chǔ)上，分析了該菌株致病因子相關(guān)基因，并進一步比較了全國菌株致病基因變異情況

3、。此外還探究了不同外源物質(zhì)處理對菌株生長的影響及對致病力的調(diào)控作用，為研究種群多樣性、致病因子變異等與生態(tài)適應(yīng)性的關(guān)系提供基礎(chǔ)，為今后青枯病的科學(xué)用藥提供可靠的理論依據(jù)。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.完成了青枯雷爾氏菌菌株CQPS-1的全基因組測序，并系統(tǒng)分析了致病因子的相關(guān)基因采用單分子實時測序技術(shù)（Single molecule real-time sequencing,SMRT）對青枯雷爾氏菌CQPS-1進行全基因組測序。

4、組裝后得到一條染色體（3.83 Mb）和一個大質(zhì)粒（2.06 Mb），基因組GC含量為66.84％。共預(yù)測到5229個編碼基因，并對基因進行了注釋。將獲得的基因組與菌株GMI1000、YC45、Y45、FQY_4、CFBP2957、PO82、CMR15和PSI07進行了比較基因組學(xué)分析，結(jié)果表明，菌株CQPS-1與4株演化型Ⅰ菌株（YC45、FQY_4、Y45、GMI1000）相比，有16個特有基因家族，共包括基因442個；與其他演化型

5、菌株（CFBP2957、PO82、CMR15、PSI07）相比，有10個特有基因家族，共包括基因625個。與GMI1000相比，菌株CQPS-1的III型分泌系統(tǒng)（T3SS）基因簇較為保守，而且除部分III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因（如RipAA，RipB和RipG7）存在一定差異外，其他致病相關(guān)基因均較保守。其中，效應(yīng)子基因RipAA出現(xiàn)顯著變異。
　　2.比較了全國煙草青枯雷爾氏菌的致病因子相關(guān)基因，明確了各個致病因子相關(guān)基因的變異

6、情況以菌株CQPS-1作為參考基因組，利用HiSeq4000（Illumina）對全國煙草青枯雷爾氏菌的106株代表菌株進行基因組重測序，并分析菌株中致病相關(guān)基因的變異情況。結(jié)果表明，106個代表菌株基因組與參考菌株CQPS-1基因組比較共有約64,741個SNP，2,977個InDel，平均每個菌株獲得371個 SV變異。所分析的致病因子相關(guān)基因中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因相對于其他類的致病基因，存在更多類型的InDel突變，而與GMI

7、1000相比差異最大的效應(yīng)子基因RipAA的編碼區(qū)域在全國煙草青枯雷爾氏菌中變異較小，僅存在一個SNP位點變異。
　　3.測定了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯對青枯雷爾氏菌的抑制生長作用和抑菌效果，明確了這些藥劑對該菌致病力的影響采用平板帶藥法測定了外源物質(zhì)對青枯雷爾氏菌的菌落生長情況，由結(jié)果可知，兩種外源物質(zhì)對青枯雷爾氏菌菌落的大小均有一定影響。利用濁度法確定了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯的IC50分別為0.38 mg/L和133.8

8、7 mg/L，然后以此濃度分別制備帶藥培養(yǎng)基，對青枯雷爾氏菌CQPS-1進行長期的繼代培養(yǎng)實驗，觀察其致病力變化情況。通過回接實驗發(fā)現(xiàn)，農(nóng)用硫酸鏈霉素繼代培養(yǎng)30次和60次后，菌株的致病力在一定程度上有增強趨勢：培養(yǎng)30次的菌株相較于清水處理菌株致病力有顯著增強的趨勢，繼代培養(yǎng)60次的菌株相較于未處理菌株CQPS-1致病力有顯著增強的趨勢。而東莨菪內(nèi)酯長期作用對菌株的致病力影響規(guī)律不明顯：當(dāng)東莨菪內(nèi)酯繼代培養(yǎng)30次時，雖相較于清水處理有

9、增強的趨勢，但是與溶劑對照相比無顯著差異；當(dāng)用東莨菪內(nèi)酯繼代培養(yǎng)60次時，與未處理菌株CQPS-1、清水對照菌株及溶劑對照菌株均無顯著性差異。
　　4.從分子水平上研究了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯長期脅迫下青枯雷爾氏菌的致病相關(guān)基因的表達情況在農(nóng)用硫酸鏈霉素長期處理過程中，菌株的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子phcA表現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢，此外，胞外多糖合成相關(guān)基因在處理前期有一定程度的升高，但是處理后期差異不顯著。東莨菪內(nèi)酯處理前期，菌株的Ⅲ型

10、分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因hrpG及關(guān)鍵毒力調(diào)節(jié)子基因pehS受到一定影響，而所選取的其他主要致病相關(guān)基因受到的影響不顯著，當(dāng)繼代培養(yǎng)60次時，所有測定的致病基因變化均不顯著。
　　綜上所述，本研究基于全基因組序列，分析了我國青枯雷爾氏菌致病相關(guān)基因的差異，發(fā)現(xiàn)了部分出現(xiàn)顯著變異的基因，如RipAA，同時，從全國菌株致病因子相關(guān)基因的變異情況比較可知，與其他類的致病基因相比，Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因存在更多類型的InDel突變。外源物質(zhì)農(nóng)用硫