桉樹青枯菌菌株致病力分化、吸附識(shí)別及PCR快速檢測(cè)研究.pdf

1、桉樹是世界三大速生造林樹種之一。隨著桉樹人工林面積的不斷擴(kuò)大，桉樹病蟲害問題也越來越突出，病蟲害種類不斷增加，危害程度愈加嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了桉樹的正常生長，降低了木材和其他林產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前在桉樹病蟲害中，青枯病的危害最嚴(yán)重，危害范圍最廣，給桉樹生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。前人曾對(duì)桉樹青枯病的病原、發(fā)病規(guī)律和防治方法等進(jìn)行了一系列研究，取得了一定進(jìn)展，但對(duì)桉樹青枯病的病原學(xué)和致病機(jī)理了解還比較少，缺乏對(duì)桉樹青枯病全面而系統(tǒng)的了解。

2、 本文對(duì)青枯菌致病力及桉樹無性系抗性分化、青枯菌遺傳多樣性、青枯菌對(duì)桉樹的吸附和侵染識(shí)別過程以及分子檢測(cè)方法等4方面進(jìn)行研究，以期深入了解桉樹青枯病的侵染發(fā)病機(jī)制，為桉樹生產(chǎn)中無性系的合理布局、防止青枯菌傳播和蔓延提供理論和技術(shù)支撐。本研究主要結(jié)果如下： (1)選用DH196和IDH32-22兩個(gè)無性系，采用水培接種法對(duì)華南地區(qū)30個(gè)桉樹青枯菌菌株致病力進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)華南地區(qū)桉樹青枯菌菌株間致病力存在顯著差異，且與地理來源之

3、間無明顯相關(guān)性，同一地區(qū)致病力強(qiáng)弱菌株并存。 (2)從30個(gè)測(cè)定的菌株中選擇強(qiáng)、中、弱各2個(gè)致病力不同的菌株與12個(gè)生產(chǎn)中常用的桉樹無性系采用灌根接種法交叉接種發(fā)現(xiàn)，供試無性系對(duì)青枯病抗性也具有一定差異，無性系DH196、T13、DH32-29抗性最弱，DH32-22、9113、21、U6、9224抗性中等，井崗一號(hào)、DH201-2、EG5和廣林9抗性較強(qiáng)。 (3)在對(duì)菌株致病力和無性系抗性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，青枯菌菌株和桉樹無

4、性系間存在顯著的交互作用，植株的發(fā)病程度取決于病菌的致病力、無性系的抗病性以及二者的交互作用。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)選擇抗性較強(qiáng)的品系，同時(shí)兼顧不同抗性無性系合理布局，充分利用無性系的抗病性控制青枯病的發(fā)生和危害。 (4)首次利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)華南地區(qū)30個(gè)桉樹青枯菌菌株的遺傳變異進(jìn)行了研究，有助于了解病菌的遺傳分化，病菌的流行學(xué)特征等多方面的信息。通過研究發(fā)現(xiàn)，來自華南地區(qū)的30個(gè)桉樹青枯菌菌株間遺傳變異較大，多態(tài)性高。不同菌株間

5、的遺傳關(guān)系與致病力強(qiáng)弱具有一定的相關(guān)性，致病性相近的菌株親緣關(guān)系較近；而菌株的遺傳關(guān)系在地域上則呈現(xiàn)大雜居小聚居的分布格局，在小的地域范圍親緣關(guān)系較近，但相距較遠(yuǎn)的地區(qū)也有親緣關(guān)系較近的菌株。 (5)用強(qiáng)弱兩菌株接種無性系DH196，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青枯菌對(duì)桉樹根部吸附識(shí)別的最適溫度條件是30℃，此時(shí)病菌新陳代謝旺盛，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)，對(duì)根表吸附量和根部侵入量高。環(huán)境中pH值為中性至弱酸時(shí)最有利于青枯菌對(duì)桉樹根表的吸附識(shí)別，此時(shí)細(xì)菌易于成

6、功吸附到根表細(xì)胞表面，進(jìn)而定殖和侵入。細(xì)菌接種濃度對(duì)吸附識(shí)別具有重要影響，高濃度青枯菌的群體效應(yīng)使青枯菌能夠克服寄主的防衛(wèi)機(jī)制成功吸附定殖，青枯菌對(duì)細(xì)胞表面的吸附可能具有特定的位置效應(yīng)，過高濃度的細(xì)菌，其吸附量和侵入量并不能繼續(xù)增加。 (6)本研究制備了粗提純的胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)，無EPS和無EPS與LPS的菌株，通過測(cè)定青枯菌的根表吸附量和根部侵入量，研究EPS和LPS在青枯菌對(duì)桉根部吸附和侵入過程中的作用。

7、結(jié)果表明：在接種青枯菌的6h內(nèi)，EPS處理后青枯菌的根表吸附量和根部侵入量明顯升高，而LPS處理后青枯菌的根表吸附量和根部侵入量都明顯下降；無EPS菌株的根表吸附量和根部侵入量都明顯降低，無EPS及LPS菌株的根表吸附量和根部侵入量亦有所下降，但不如無EPS菌株下降明顯。EPS具有促進(jìn)青枯菌對(duì)桉樹根部吸附和侵入的作用，LPS則具有抑制作用。 (7)使用致病力強(qiáng)弱不同的5號(hào)和12號(hào)菌株接種桉苗，在接種后1.0h、2.0h、4.0h

8、、6.0h、24h分別取樣，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，青枯菌的根表吸附量在初始的6.0h時(shí)間里具有明顯的積累效應(yīng)，強(qiáng)毒菌株的根表吸附量明顯高于弱毒菌株，并開始在根表增殖，與細(xì)胞發(fā)生作用，侵入寄主。 (8)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，青枯菌侵入桉苗無傷幼根的途徑可能是通過青枯菌分解作用，破壞根表細(xì)胞壁進(jìn)入根內(nèi)。青枯菌能分解根表細(xì)胞壁，使根表細(xì)胞變形，細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的縫隙，進(jìn)而從縫隙間侵入寄主。本研究證明了青枯菌是在桉樹維管束導(dǎo)管及相鄰組織內(nèi)迅速增

9、殖和廣泛分布堵塞輸水管而導(dǎo)致桉樹枯萎。桉苗接種青枯菌2.0h，根莖切片只發(fā)現(xiàn)少許白色的濃密物質(zhì)，6.0h后，也只能看到稀少的幾個(gè)病菌，但接種24h后，就可以觀察到大量的病菌存在于維管束的導(dǎo)管及細(xì)胞間隙，堵塞導(dǎo)管并引起植株表現(xiàn)枯萎癥狀。 (9)以帶有青枯菌的桉樹組織為材料，采用4種不同的提取方法抽提青枯菌DNA，同時(shí)利用青枯菌特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，比較了4種DNA提取方法及PCR檢測(cè)靈敏度。結(jié)果表明，煮沸法和熱裂解法操作相對(duì)