一株海綿共生芽孢桿菌的抗硅藻附著活性物質(zhì)的分離與鑒定.pdf

1、海洋微生物由于其特殊的海洋生存環(huán)境，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎且活性多樣的代謝產(chǎn)物，從其中尋求具有特異活性的天然產(chǎn)物是開(kāi)發(fā)海洋資源的重要研究方向。海洋生物污損是一直是困擾人類(lèi)的棘手難題，現(xiàn)行的防污措施都只是臨時(shí)尋找對(duì)環(huán)境危害相對(duì)較小的化合物進(jìn)行防治，沒(méi)有從根本上解決問(wèn)題。開(kāi)發(fā)高效、無(wú)毒、環(huán)境友好的活性化合物，是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)解決途徑。越來(lái)越多的證據(jù)表明，海綿獨(dú)特的防污損化學(xué)機(jī)制，很有可能來(lái)源于其共附生的微生物。因此，從海綿共附生微生物中尋找天然抗污

2、損活性物質(zhì)，是解決海洋生物污損的重要且可行的方案。
　　本研究針對(duì)一株海綿共附生細(xì)菌UST050418-715菌株，進(jìn)行了抗硅藻附著活性的測(cè)定、菌種鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、細(xì)菌發(fā)酵、活性指導(dǎo)下的活性化合物分離和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果如下:
　　(1)試驗(yàn)菌株的篩選與菌種鑒定
　　實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)篩選出有抗硅藻附著活性的海綿共附生細(xì)菌，選取其中4株:UST050418-315、UST050418-694、UST050418-708

3、和UST050418-715，進(jìn)行三種硅藻（小新月菱形藻、、咖啡雙眉藻、碎片菱形藻）的活性驗(yàn)證。結(jié)果表明，這4株測(cè)試細(xì)菌均對(duì)三種附著硅藻（小新月菱形藻（Nitzschia closterium）、咖啡雙眉藻(Amphora coffeaeformis)和碎片菱形藻（Nitzschia frustulum））有明顯的抑制作用，平均抑制率都超過(guò)90％。其中菌株UST050418-715對(duì)三種附著硅藻都有較強(qiáng)的抑制附著作用，對(duì)測(cè)試硅藻的抑制率

4、均≥90％，平均抑制率達(dá)92.1％，因此選定試驗(yàn)菌株為UST050418-715。
　　通過(guò)16S rDNA的測(cè)序分析，結(jié)合平板的菌落形態(tài)和掃描電鏡下菌體特征，鑒定菌株UST050418-715為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。
　　(2)菌株UST050418-715發(fā)酵條件優(yōu)化
　　針對(duì)菌株UST050418-715進(jìn)行了四因素三水平的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這四種因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響從大到小的順序依次:酵母

5、粉＞蛋白胨＞ NaCl＞ pH。
　　通過(guò)正交試驗(yàn)，結(jié)合菌株發(fā)酵粗提物活性、粗提物產(chǎn)量和菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)各發(fā)酵條件對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)量有極顯著的影響，因此結(jié)合三個(gè)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果確定了菌株UST050418-715的最佳發(fā)酵條件為:蛋白胨濃度為7.5g/L，酵母粉濃度為3g/L，NaCl濃度為10.45g/L，pH9.5。
　　(3)菌株UST050418-715活性物質(zhì)的分離和結(jié)構(gòu)鑒定
　　對(duì)菌株UST05041

6、8-715進(jìn)行發(fā)酵，積累粗提物。以抗硅藻附著的活性為導(dǎo)向，對(duì)粗提物進(jìn)行逐步的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。分離步驟:1）初步分離:用不同溶劑萃取將粗提物按照極性大小分為5個(gè)組分，石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，分別記為Fr-1～ Fr-5。用顯微計(jì)數(shù)測(cè)定5個(gè)組分的抗硅藻附著活性，HPLC分析各組分，其中二氯甲烷相(Fr-2)活性最好，乙酸乙酯相極性適中易于分離。2）半制備色譜分離:用恒定40％的甲醇作流動(dòng)相洗脫分離Fr-3，得到

7、Fr-3.1～Fr-3.7，其中Fr-3.2*、Fr-3.5*、Fr-3.6、Fr-3.7*較純，F(xiàn)r-3.3活性較好。用40％的甲醇洗脫Fr-2進(jìn)行半制備HPLC分離，得到Fr-2.1～Fr-2.8，其中Fr-2.1、Fr-2.3*、Fr-2.5*較純，F(xiàn)r-2.4、Fr-2.6、Fr-2.7、Fr-8有較好的活性。3)半制備HPLC進(jìn)--步分離:對(duì)活性較好的組分:Fr-3.3、Fr-2.4、Fr-2.6和Fr-2.7進(jìn)一步的半制備H

8、PLC分離，得到Fr-3.3.1～Fr-3.3.8。Fr-2.4.1～Fr-2.4.6、Fr-2.6.1～Fr-2.6.6和Fr-2.7.1～Fr-2.7.3。進(jìn)一步分離Fr-2.6.2，得到Fr-2.6.2.1～Fr-2.6.2.4。通過(guò)以上分離，選取較純或活性較好的34個(gè)組分進(jìn)行GC-MS分析，其中12個(gè)組分較純，對(duì)其進(jìn)行1H-NMR分析。
　　通過(guò)GC-MS的分子質(zhì)量分析和1H-NMR分析，可以鑒定出Fr-2.3*、Fr-2

9、.4.2和Fr-3.5*的主要成分為同種物質(zhì)，環(huán)(L-亮氨酸-L-脯氨酸)[Cyclo(L-Leu-L-Pro)]，其抑制率分別為12.7％±8.4％、28.5％±3.5％和30.7％±5.0％; Fr-2.4.3的平面結(jié)構(gòu)為環(huán)（纈氨酸-脯氨酸）[Cyclo(Val-Pro)]，其抑制率為28.0％±10.4％;Fr-2.6.5為環(huán)(D-脯氨酸-L-亮氨酸)[Cyclo(D-Pro-L-Leu)]，其抑制率為28.0％±12.6％; F

10、r-2.7.1為環(huán)(L-脯氨酸-D-亮氨酸)[Cyclo-(L-Pro-D-Leu)]，其抑制率為18.0％±2.8％;Fr-3.2*為環(huán)（甘氨酸-D-脯氨酸）[Cyclo-(Gly-D-Pro)]，其抑制率為46.3％±10.8％; Fr-3.6為環(huán)（4R-D-羥脯氨酸-L-苯丙氨酸）[Cyclo(4R-D-Hydroxypro-L-Phe)]，其抑制率為28.7％±11.3％; Fr-3.7*為環(huán)(4R-L-羥脯氨酸-L-苯丙氨酸)