活性芽孢桿菌的分離、鑒定

1、活性芽孢桿菌的分離、鑒定與育種,閆恒 黃瑞輝 段花蕊,引言,芽孢桿菌能產(chǎn)生多種消化酶，幫助動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。芽孢桿菌具有較強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同時(shí)還具有降解飼料中復(fù)雜碳水化合物的酶，如果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等而淀粉酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,在造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域具

2、有廣闊的用途。現(xiàn)在淀粉酶主要來源于植物和微生物并通過發(fā)酵完成生產(chǎn)，因此篩選出高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌是淀粉酶生產(chǎn)的頭等大事。本實(shí)驗(yàn)從土壤中分離出產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌，通過誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化來得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌株,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握如何設(shè)計(jì)分離生物活性菌株的實(shí)驗(yàn)方案;掌握誘變育種各方法的基本原理和操作;掌握原核微生物多相分類的總體方法及表型、基因型和系統(tǒng)發(fā)育分析的主要技術(shù):掌握微生物菌種的冷凍干燥保藏和液氮超低溫保藏的原

3、理和方法。了解活性菌株產(chǎn)物測(cè)定(淀粉酶活性，纖維素酶活性，蛋白酶活性) 的相關(guān)方法及其原理(測(cè)定方法，儀器的使用),實(shí)驗(yàn)材料與儀器,1、實(shí)驗(yàn)材料：河北大學(xué)生科樓院前土壤2、儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基分裝器、PH試紙、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、試管、試管架、酒精燈、電子天平、顯微鏡、三角燒瓶、洗瓶、接種針、接種環(huán)、雙層瓶、擦鏡紙、德漢氏小管、直尺、記號(hào)筆等。誘變箱：微波爐（E30E-3）離心機(jī)、72

4、1分光光度計(jì)；3、培養(yǎng)基和試劑：（1）培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、蛋白胨液體培養(yǎng)基（吲哚實(shí)驗(yàn)）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P.、M．R實(shí)驗(yàn)）、硝酸鹽液體培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基（2）試劑：碘液、孔雀綠染液、番紅染液、乙醚、吲哚試劑、KOH、α-耐酚、甲基紅、格里斯氏試劑、鋅粉、3%H2O2 、檸檬酸緩沖液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水楊酸,實(shí)驗(yàn)流程,活性菌株

5、的分離篩選誘變育種高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化活性菌株的鑒定菌種保藏,一、活性菌株的分離篩選,1.原理：目前，土壤芽孢桿菌分離方法主要有兩種，一種是根據(jù)在平板上所生長的菌落，鑒定出芽孢桿菌，該方法主要問題是由于微生物種群繁多，會(huì)影響分離結(jié)果；另一種是先加熱以殺死非芽孢細(xì)菌，再根據(jù)菌落特征，分離出芽孢桿菌，該方法簡單易行，是目前常用的方法，篩選一些特殊芽孢桿菌時(shí)多用此方法。用于分離芽孢桿菌的培養(yǎng)基有多種，最常用的有牛肉膏蛋白胨瓊脂和麥

6、芽汁牛肉膏蛋白胨瓊脂，其中麥芽汁培養(yǎng)基分離得到的菌落直觀、分散，易于計(jì)數(shù)，可作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。產(chǎn)淀粉酶的活性芽孢桿菌常使用淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行分離，在平板上滴加碘液，可產(chǎn)生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不變藍(lán)，在培養(yǎng)基表面形成透明圈。淀粉培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基。測(cè)定淀粉酶的活性可以把待測(cè)菌株種在淀粉培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)定透明圈與菌落直徑的比值（H/C值）大小來衡量淀粉酶活力高低。初篩是指從大量的菌落中隨機(jī)挑取進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)并通過檢測(cè)得到一些較優(yōu)菌株

7、；復(fù)篩是指將初篩得到的較優(yōu)菌株再進(jìn)行多次搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其效價(jià)和傳代穩(wěn)定性，并從中得到一兩個(gè)或少數(shù)幾個(gè)最優(yōu)的菌株。,一、活性菌株的分離篩選,實(shí)驗(yàn)步驟：采集土樣, 稱取 5 g土樣, 放入裝有 45mL無菌水的三角瓶中, 震 蕩 20m in后靜置 5m in , 然后進(jìn)行濃度梯度稀釋到10-4、10-5、10-6 把10-4、10-5、10-6分別涂布到淀粉培養(yǎng)基上，37℃倒置、過夜培養(yǎng)，影印，將碘液加到淀粉平板上，記錄出現(xiàn)水解圈的單菌落

8、的d0 /d1 (d0 為水解圈直徑, d1 為菌落直徑 )。將出現(xiàn)水解圈的菌落進(jìn)行芽孢染色，顯微觀察菌種形態(tài)。挑選有明顯透明圈的單菌落, 制成斜面。復(fù)篩: 將初篩得到的較優(yōu)菌株再進(jìn)行多次搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其效價(jià)和傳代穩(wěn)定性，并從中得到一兩個(gè)或少數(shù)幾個(gè)最優(yōu)的菌株,二、紫外誘變,誘變育種: 即用人工誘變的方法誘發(fā)微生物基因突變，通過篩選，從多種多樣的突變體中篩選出產(chǎn)量高、性能優(yōu)良的突變體。1.原理：紫外線作為物理誘變因子用于工業(yè)微生物菌種的

9、誘變處理具有悠久的歷史，盡管幾十年來各種新的誘變劑不斷出現(xiàn)和被應(yīng)用于誘變育種，但到目前為止，對(duì)于經(jīng)誘變處理后得到的高單位抗生素產(chǎn)生菌種中，有80%左右是通過紫外線誘變后經(jīng)篩選而獲得的。因此，對(duì)于微生物菌種選育工作者來說，紫外線作為誘變因子還是應(yīng)該首先考慮的。紫外線的波長在200~380 nm 之間，但對(duì)誘變最有效的波長僅僅是在253~265 nm，一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254 nm。紫外線對(duì)微生物有誘變作用，主要

10、引起是DNA的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對(duì)，引起微生物突變或死亡），從而引起菌體遺傳性變異。經(jīng)紫外線損傷的DNA，能被可見光復(fù)活，因此，經(jīng)誘變處理后的微生物菌種要避免長波紫外線和可見光的照射，故經(jīng)紫外線照射后樣品需用黑紙或黑布包裹。另外，照射處理后的孢子懸液不要貯放太久，以免突變?cè)诤诎抵行迯?fù)。,二、紫外誘變,2.實(shí)驗(yàn)步驟：將初步篩選產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株從斜面接種到液體培養(yǎng)基中,3

11、7℃振蕩培養(yǎng)2d后,吸菌液以1∶10的接種量轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)1d后的菌液用于紫外誘變。取菌液4mL于滅菌后的培養(yǎng)皿中,置于20W紫外燈下25cm處間歇照射4min,用無菌水梯度稀釋涂平板,然后用黑布包好置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以未經(jīng)紫外處理的為對(duì)照。第2天統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù),計(jì)算致死率,正突變率,挑選突變菌株點(diǎn)種到淀粉培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)42h,通過比較突變株與原始菌株的d0 /d1值,篩選產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。紫外誘

12、變后所有操作在紅燈下進(jìn)行。將篩選的優(yōu)良突變株進(jìn)行第二次誘變,方法同原始菌株的誘變。誘變后將突變株點(diǎn)種到淀粉培養(yǎng)基上,以第一次誘變的突變株為對(duì)照,通過比較第二次誘變的突變株與對(duì)照的d0 /d1值,篩選產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。稀釋菌液并涂布到淀粉培養(yǎng)基平板上，37℃下過夜培養(yǎng)，分別測(cè)水解圈的d0 /d1值，將正突變的菌種接種到種子培養(yǎng)基瓶中35℃培養(yǎng)12h。然后以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，37℃，160r/min培養(yǎng)48h。發(fā)酵后24h補(bǔ)加

13、碳酸鈣。離心(4000r/min,20min),收集上清液即為待測(cè)粗酶液。,3.原始菌株及突變株產(chǎn)酶能力的測(cè)定及其產(chǎn)酶穩(wěn)定性檢測(cè)（1）.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(見下表)①取7支20 ml具塞刻度試管,預(yù)先潔凈滅菌干燥,編號(hào),按表加入試劑。②搖勻,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻,加蒸餾水定容至20 ml,以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn),在540 nm的波長下比色測(cè)定吸光度值。并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。,表2 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液

14、成分表及OD測(cè)定值,(2)粗酶液淀粉酶活力測(cè)定按以下順序操作：取20 ml具塞刻度試管,預(yù)先潔凈滅菌干燥,編號(hào)。取粗酶液1 ml于各只刻度試管中，于60℃水浴中預(yù)熱5min檸檬酸淀粉緩沖液同時(shí)在60℃水中預(yù)熱5min，→取檸檬酸淀粉緩沖液1ml加入具塞刻度試管中,于60℃水浴中保溫30min→加入1.5 ml 3,5-二硝基水楊酸,沸水中5 min,迅速冷卻,加蒸餾水定容至20 ml。③定容后,搖勻,用分光光度計(jì)測(cè)定OD540 nm

15、值。在上述條件下以單位體積樣品在30 min釋放1 mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)麥芽糖單位表示酶活性。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量按下列公式計(jì)算酶活力酶活力測(cè)定公式：淀粉酶活力=麥芽糖含量（mg）·淀粉酶原液總體積（mL）/所加淀粉質(zhì)量后培養(yǎng)：應(yīng)讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，使細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。,三、高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化,1.原理：以淀粉酶的活力做為檢測(cè)的指標(biāo)。采用

16、單因素試驗(yàn)篩選高產(chǎn)菌生長及產(chǎn)淀粉酶的最佳碳源和最佳氮源，通過正交試驗(yàn)對(duì)高產(chǎn)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立高產(chǎn)菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。經(jīng)相關(guān)文件檢索，本實(shí)驗(yàn)選則碳源濃度、氮源濃度、無機(jī)鹽濃度、接種量四個(gè)對(duì)于發(fā)酵較重要的因素進(jìn)行優(yōu)化。2. 材料與儀器： 高產(chǎn)菌株斜面控溫?fù)u床、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、PH試紙、紫外分光光度計(jì) 種子液培養(yǎng)、初始發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、玉米粉1. 6%、酵母膏1. 6%、尿素0. 2

17、%、黃豆餅粉1. 6%、0．05% CaCO3、Zn SO4、CuSO4、Mn SO4·H2O、Mg SO4·7H2O,三、高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化,3.實(shí)驗(yàn)步驟3.1 種子液培養(yǎng) 接種1環(huán)高產(chǎn)菌株于盛有50mL種子培養(yǎng)基的250m L 三角瓶中，37℃ ，180r /min振蕩培養(yǎng)24h，調(diào)整菌液濃度為108 / m L，作發(fā)酵用種子液。3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按10%的接種量接入至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基

18、的250mL 三角瓶中，28℃，180r / min振蕩培養(yǎng)36h。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。3.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化生產(chǎn)條件（1）培養(yǎng)基碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響：在不含可溶性淀粉的培養(yǎng)基中，分別用等量的蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖做碳源進(jìn)行碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。按 50mL/ 250 mL裝液量、6%接種量、pH7.0、以200 r/min在37 ℃培養(yǎng)，測(cè)定搖瓶發(fā)酵24h后淀

19、粉酶的活力。,三、高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化,。2）培養(yǎng)基氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響：以所選最優(yōu)碳源為基礎(chǔ)，其他成分不變，分別以等量的玉米粉1. 6%、酵母膏1. 6%、尿素0. 2%、黃豆餅粉1. 6%替代蛋白胨0.8%，同時(shí)以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。按 50mL/ 250 mL裝液量、6%接種量、pH7.0、以200 r/min在37 ℃培養(yǎng)，測(cè)定搖瓶發(fā)酵24h后淀粉酶的活力。（3）無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響：在所選最優(yōu)碳、氮源為培養(yǎng)成分下，分別添加0．0

20、5% CaCO3、Zn SO4、CuSO4、Mn SO4·H2O、Mg SO4·7H2O替代NaCl。同時(shí)以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。按 50mL/ 250 mL裝液量、6%接種量、pH7.0、以200 r/min在37 ℃培養(yǎng)，測(cè)定搖瓶發(fā)酵24h后淀粉酶的活力。,三、高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化,3.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)： 根據(jù)3.5.3的試驗(yàn)結(jié)果，采用四因素三水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并以淀粉酶活力為主要參考指標(biāo)，每組進(jìn)行3次重復(fù)，確

21、定最佳搖瓶發(fā)酵條件。,表1,表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),三、高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化,,三、高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化,3.5培養(yǎng)時(shí)間及搖床轉(zhuǎn)速對(duì)搖瓶發(fā)酵的影響：（1）溫度：采用最優(yōu)培養(yǎng)基及接種量，按50mL/ 250 mL裝液量、pH7.0、以200 r/min分別在25，28，30，37，42 ℃培養(yǎng)，測(cè)定搖瓶發(fā)酵24h后淀粉酶的活力。（2）培養(yǎng)時(shí)間：采用最優(yōu)培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及接種量，按50mL/ 250 mL裝液量、pH7.0、以20

22、0 r/min培養(yǎng)，分別測(cè)定搖瓶發(fā)酵12，24，36，48 h后淀粉酶的活力。（2）轉(zhuǎn)速：采用最優(yōu)培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及接種量，分別以0，160，180，200 r/min搖床轉(zhuǎn)速按50mL/ 250 mL裝液量、pH7.0培養(yǎng)，測(cè)定搖瓶發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的淀粉酶的活力。,四、活性菌株的鑒定,利用多相分類的方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行鑒定：形態(tài)鑒定：個(gè)體和群體形態(tài)鑒定生理生化反應(yīng)：將誘變得到的正突變菌株進(jìn)行以下反應(yīng)：糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、

23、V.P實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、酪素水解實(shí)驗(yàn)、耐鹽實(shí)驗(yàn)。,四、活性菌株的鑒定,利用多相分類的方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行鑒定：1.形態(tài)鑒定：取培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)樣品，挑取單菌落制片，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察記錄染色結(jié)果；用孔雀綠、番紅染色，鏡檢，觀察記錄菌體、芽孢的形態(tài)及芽孢著生位置。用培養(yǎng)平板，觀察記錄單個(gè)菌落形態(tài)特征。芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，呈直桿狀，可產(chǎn)莢膜，可運(yùn)動(dòng)

24、（周生鞭毛）；芽孢中生或近中生，小于或等于細(xì)胞寬，成橢圓至圓柱狀；菌落粗糙、不透明、擴(kuò)張、污白色或微帶黃色。,四、活性菌株的鑒定,生理生化反應(yīng)：將誘變得到的菌株進(jìn)行以下反應(yīng)：（1）糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管2支，一支接種所分離菌種，另一支不接種，作為對(duì)照。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支，同樣1支接種所分離菌種，另一支不接種，作為對(duì)照。將已接種的葡萄糖和乳糖發(fā)酵試管和對(duì)照管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。芽孢桿菌

25、可以分解利用葡萄糖，但不能分解利用乳糖。（2）甲基紅實(shí)驗(yàn)：在裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液的試管中，接種所分離的菌株，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，加入2～3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“＋”或“－”表示。芽孢桿菌在滴加甲基紅后會(huì)變紅，結(jié)果呈陽性，說明芽孢桿菌代謝糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。（3）V.P實(shí)驗(yàn)：在培養(yǎng)芽孢桿菌的試管中，加40%KOH15滴，震蕩，再加等量α

26、-萘酚，震蕩，37℃震蕩培養(yǎng)30min,觀察。結(jié)果不變紅，呈陰性，說明芽孢桿菌不能代謝糖產(chǎn)非酸性或中性末端產(chǎn)物。（4）檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)：將被檢菌種接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)1-4天，每日觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色，則為陽性；不能利用檸檬酸鹽作為碳源的細(xì)菌，在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基不變色，為陰性。芽孢桿菌不能利用檸檬酸鹽，無變藍(lán)，結(jié)果呈陰性。,四、活性菌株的鑒定,（5）吲哚實(shí)驗(yàn)：將菌

27、接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中,37℃下，在培養(yǎng)液中加入乙醚1～2ml，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑(加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察)，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“+”、陰性用“-”表示。無玫瑰紅，結(jié)果呈陰性，說明芽孢桿菌不能產(chǎn)生色氨酸酶。（6）H2S實(shí)驗(yàn)：在SIM培養(yǎng)基中接種所分離的菌株，將所有試管置于37℃下培養(yǎng)24-

28、48小時(shí)，觀察接種線有無黑色產(chǎn)生，記錄下來，依觀察所見，判斷各菌是否具有產(chǎn)生硫化氫之能力。無變黑，結(jié)果呈陰性，說明該菌株沒有產(chǎn)生硫化氫之能力。（7）硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1-4d。將A、B液等量混合液(用時(shí)混合)0.1ml加于試管內(nèi)，立即或10min內(nèi)觀察結(jié)果。做此試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)以一支未接種細(xì)菌的培養(yǎng)基做對(duì)照試驗(yàn)，只有對(duì)照管陰性時(shí)，才能判定。當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否被分解，可

29、取鋅粉少許加入培養(yǎng)基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色表明硝酸鹽仍存在;若不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。(滴加格里斯試劑后，培養(yǎng)基顏色變?yōu)槊倒寮t，結(jié)果呈陽性，說明該菌能顧將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽)（8）明膠水解實(shí)驗(yàn)：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高，培養(yǎng)基自行溶化時(shí)，可與冰箱內(nèi)放置30分鐘，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固時(shí)為陽性。(結(jié)果呈陰性),四、活性菌株的鑒定,（9）過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：挑取培養(yǎng)基中菌落一接種

30、環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2mL，觀察結(jié)果。于半分鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。（有氣泡產(chǎn)生，結(jié)果呈陽性，表明具有過氧化氫酶。）（10）酪素水解實(shí)驗(yàn)：牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中（或用50mL脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至45－50℃時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接3－5株

31、菌。適溫培養(yǎng)1、3、5天，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。     配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。  酪氨酸水解：將酪氨酸0.5g懸浮于10mL蒸餾水中，115℃，20分鐘滅菌，然后于100mL無菌的營養(yǎng)肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固后，將測(cè)試菌接種于平皿上，培養(yǎng)7到14d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明（出現(xiàn)水解圈，結(jié)果

32、呈陽性）（11）耐鹽實(shí)驗(yàn)：配置一系列鹽濃度梯度的培養(yǎng)基，接種所得菌，觀察記錄菌落生長情況和數(shù)目，找出菌濃度最高和最低時(shí)的培養(yǎng)基內(nèi)鹽濃度，記錄。（鹽濃度為3%、5%、7%的培養(yǎng)基中均有生長的菌落，其中鹽濃度為3%的培養(yǎng)基中菌濃度最高，7%最少，結(jié)果呈陽性）（12）淀粉水解實(shí)驗(yàn)：將菌種涂布接種于淀粉瓊脂平板或斜面，于37 ℃培養(yǎng)（24～48） h，或于20 ℃培養(yǎng)5 d。然后將碘液直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘液于

33、試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)。（變藍(lán)，出現(xiàn)透明環(huán)，陽性結(jié)果）。綜合上述實(shí)驗(yàn)，可確定所分離菌株是否為芽孢桿菌及其種類。,五、菌種保藏,原理：菌種保藏是指廣泛收集并妥善保藏實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)用菌種、菌株(包括病毒株、動(dòng)植物細(xì)胞株、質(zhì)粒等)，使之不死、不衰、不污染，以便于研究、交換和使用。本實(shí)驗(yàn)：將菌種轉(zhuǎn)接在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用油紙將棉

34、塞部分包扎好，置4℃冰箱中保藏。,二、附錄（一）、培養(yǎng)基的配制1、淀粉培養(yǎng)基蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000mL，瓊脂15~20g，121℃滅菌20min2、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，蒸餾水1000mL，瓊脂15~20g，121℃滅菌20min，pH7.0~7.23、種子培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl1%，瓊脂2%，可溶性淀粉0.25%4、發(fā)

35、酵培養(yǎng)基玉米粉10g，淀粉15g，豆粉20g，酵母粉3g，KH2PO4 0.3g，ZnSO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，pH7.05、糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1.6g溴甲酚紫溶解到100mL乙醇中）1~2mL，pH7.6，另配20%糖溶液，蛋白胨水121℃滅菌20分，20%糖溶液112℃滅菌30 min，分別滅菌后再混合。6、明膠培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨液100mL

36、，明膠12~18g，pH7.2~7.4，在水浴鍋中將上述成分溶化，不斷攪拌溶化后調(diào)pH，121攝氏度滅菌30 min,7、檸檬酸鹽培養(yǎng)基NH4H2PO41g，K2HPO41g，NaCl5g，MgSO40.2g，檸檬酸鈉2g，瓊脂15~20g，蒸餾水1000mL，1%溴香草酚藍(lán)乙醇液10mL，將上述各成分加熱溶解后，調(diào)pH6.8，然后加入指示劑，搖勻，用脫脂棉過濾。制成后為黃綠色，分裝試管，121攝氏度滅菌20 min后制成斜面。8、

37、醋酸鉛培養(yǎng)基pH7.4的牛肉膏蛋白胨瓊脂100mL，硫代硫酸鈉0.25g，10%醋酸鉛水溶液1mL，將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加熱溶解，待冷卻至60攝氏度加入硫代硫酸鈉調(diào)pH7.2分裝于三角瓶中，115攝氏度滅菌15 min。取出后待冷至55~60攝氏度，加入醋酸鉛水溶液，混勻后倒入滅菌試管中。9、吲哚培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水1000mL，pH7.6，121攝氏度滅菌20 min10、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P.、

38、M．R實(shí)驗(yàn)）蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，蒸餾水1000mL，將上述各成分溶于水中，調(diào)pH7.0~7.2，分裝試管，112攝氏度滅菌30 min。11、硝酸鹽液體培養(yǎng)基MgSO40.05%，K2HPO40.05%，KNO30.1%，蔗糖2%，NaCl0.05%，Ph7.2，115攝氏度高壓蒸汽滅菌30 min。,12、酪素培養(yǎng)基A液：Na2HPO4·7H2O 1.07g，干酪素4g，加適量蒸餾水，并加熱溶

39、解B液：KH2PO4 0.36g，加水溶解A、B液混合后，加入酪素水解液0.3mL，加瓊脂20g最后用蒸餾水定容至1000mL。酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于堿性緩沖液中，加入1%的枯草芽孢桿菌蛋白酶25mL加水至100mL，30攝氏度水解1h。用于配制培養(yǎng)基時(shí)其用量為1000mL培養(yǎng)基加入100mL水解液。13、耐鹽試驗(yàn)所用培養(yǎng)基蛋白胨10g，氯化鈉（分別為30g、50g、70g），牛肉膏3g，蒸餾水1000mL，瓊脂15

40、~20g，121℃滅菌20min，pH7.0~7.2（二）、試劑1、碘液碘片1g，碘化鉀2g，蒸餾水300mL。先用少量（3~5mL）蒸餾水溶解碘化鉀，再投入碘片待碘全溶解后，加入水稀釋至300mL。放置棕色瓶中待用。2,、吲哚試劑對(duì)二甲基氨基苯甲醛2g，95%乙醇190mL，濃鹽酸40mL。3、甲基紅試劑甲基紅0.04g，95%乙醇60mL，蒸餾水40mL，先將甲基紅溶于乙醇中然后加入蒸餾水。,4、格里斯氏試劑A液：對(duì)

41、氨基苯磺酸0.5g，10%稀醋酸150mLB液：α-萘胺0.1g，蒸餾水20mL，10%稀醋酸150mL5、0.1%標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液稱取100mg麥芽糖,用蒸餾水溶解并定容至100ml。6、1% 3,5-二硝基水楊酸試劑稱取1 g 3,5-二硝基水楊酸,溶于20 ml濃度2 mol/L氫氧化鈉溶液中,加入50 ml蒸餾水,再加入30 g四水酒石酸鉀鈉(C4H4KNaO6·4H2O)待溶解后用蒸餾水定容至100 ml,蓋