人乳頭瘤病毒L1基因在酵母體外翻譯系統(tǒng)和原代角質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、為進(jìn)一步闡明L1基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制，我們利用不同分化階段的小鼠和人的原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和角質(zhì)細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)，研究野生型和優(yōu)化型的HPV6bL1基因隨細(xì)胞分化的不同轉(zhuǎn)錄和翻譯特點(diǎn)，試圖進(jìn)一步解析影響L1蛋白在角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制。一、HPV58L1 mRNA在優(yōu)化的酵母體外翻譯系統(tǒng)中的表達(dá)研究研究中首先以含有HPV58全基因組的質(zhì)粒pLink322-HPV58為模板，PCR法擴(kuò)增HPV58全長(zhǎng)型L1基因(LL1)和截短型L

2、1基因(SL1)并連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.0上，構(gòu)建出真核重組質(zhì)粒pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定序列無(wú)誤。進(jìn)而利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1中的L1基因體外轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的長(zhǎng)短L1 mRNA備用。 為構(gòu)建酵母體外翻譯系統(tǒng)，我們首先制備了酵母的原生質(zhì)體，然后根據(jù)以往報(bào)道方法制備啤酒酵母細(xì)胞的裂解物，并對(duì)制備過(guò)程進(jìn)行了調(diào)整和改良?？紤]到裂解緩沖液中的鎂離子，鉀離子濃度

3、會(huì)影響外源性mRNA翻譯活性，我們針對(duì)HPV58L1 mRNA在酵母體外翻譯系統(tǒng)中的翻譯條件需求對(duì)鎂離子和鉀離子濃度進(jìn)行了優(yōu)化。為檢測(cè)蔗糖對(duì)酵母裂解物穩(wěn)定性的影響，我們?cè)诹呀馕锏闹苽溥^(guò)程中分別加入不同濃度的蔗糖，并檢測(cè)其對(duì)系統(tǒng)的保護(hù)作用。為確定系統(tǒng)優(yōu)化后翻譯效率的提高程度，檢測(cè)了優(yōu)化前后酵母系統(tǒng)對(duì)HPV58SL1的翻譯效率，并比較了與商品化的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)(RRL)的翻譯效率的差異，已知?jiǎng)┝康腍PV6bL1蛋白作為信號(hào)強(qiáng)度對(duì)照

4、。 結(jié)果顯示，我們構(gòu)建的體外翻譯系統(tǒng)對(duì)HPV58L1 mRNA翻譯活性良好。鎂離子和鉀離子對(duì)L1蛋白翻譯的影響顯著，鎂離子在裂解緩沖液中濃度為2.2mM時(shí)系統(tǒng)翻譯活性最高，鉀離子的最佳濃度為220mM。加入蔗糖后裂解物的抗凍融能力都有較大的提高，蔗糖的最佳濃度為100mM。對(duì)酵母體外翻譯系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化后，HPV58SL1 mRNA的翻譯效率比RRL系統(tǒng)高出2倍。經(jīng)計(jì)算，優(yōu)化前1μg SL1mRNA在1毫升反應(yīng)液中蛋白的產(chǎn)量為20-

5、40μg，優(yōu)化后為50-70μg，產(chǎn)量提高了1倍。 為進(jìn)一步研究HPV58長(zhǎng)短L1 mRNA在該系統(tǒng)中的翻譯特點(diǎn)和差異，我們?cè)趦?yōu)化的酵母體外翻譯系統(tǒng)中加入HPV58全長(zhǎng)和截短型L1 mRNA，分別進(jìn)行體外翻譯反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中改變反應(yīng)時(shí)間、L1 mRNA模板量，加入外源性氨基酸或亮氨酸和酵母的氨基酰tRNA等，觀察其對(duì)長(zhǎng)短L1蛋白合成的影響。結(jié)果顯示HPV58長(zhǎng)短L1 mRNA均可以在酵母系統(tǒng)中獲得良好的表達(dá)。對(duì)比兩者的翻譯模式，

6、截短型L1翻譯啟動(dòng)迅速，10分鐘內(nèi)即達(dá)最高表達(dá)量；全長(zhǎng)型L1翻譯啟動(dòng)較慢，反應(yīng)30分鐘后表達(dá)量與截短型持平。提示全長(zhǎng)型L1蛋白的翻譯依賴于反應(yīng)時(shí)間，而截短型L1則不明顯。隨初始mRNA模板量的增高，兩種L1蛋白信號(hào)均明顯增強(qiáng)，但截短型L1 mRNA翻譯水平仍明顯高于全長(zhǎng)型L1mRNA。外源性的氨基酸的加入僅可以顯著提高全長(zhǎng)型L1蛋白的翻譯，而對(duì)截短型L1蛋白的翻譯沒(méi)有影響，提示內(nèi)源性的氨基酸無(wú)法滿足全長(zhǎng)L1蛋白合成的需要。加入外源性酵母

7、aa-tRNA對(duì)兩種L1蛋白的翻譯均無(wú)明顯影響，提示系統(tǒng)中內(nèi)源性的tRNA可充分滿足HPV58兩種L1 mRNA的表達(dá)。 為進(jìn)一步揭示長(zhǎng)短L1蛋白合成效率的差異原因，我們?cè)诜磻?yīng)系統(tǒng)中加入不同濃度的外源性的亮氨酸，觀察其對(duì)兩種L1蛋白合成的影響。為檢測(cè)體外合成的L1蛋白是否可以組成VLP顆粒，將體外翻譯的反應(yīng)液直接進(jìn)行蔗糖超速離心后透射電鏡檢測(cè)VLP顆粒的形成。Western Blot結(jié)果顯示，亮氨酸可以提高全長(zhǎng)型的L1mRNA的

8、翻譯水平，且效應(yīng)呈亮氨酸劑量依賴性；而截短型L1翻譯不受影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)中亮氨酸的缺乏是限制HPV58全長(zhǎng)型L1表達(dá)的重要因素，這是由于長(zhǎng)L1蛋白起始序列中亮氨酸的高頻率使用所導(dǎo)致。電鏡結(jié)果顯示全長(zhǎng)和截短型L1蛋白均可以組裝成VLP顆粒。 綜上所述，本部分中我們成功地構(gòu)建了一種新型的適合HPV58L1蛋白合成的酵母無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)HPV58L1蛋白合成所需的各成分濃度進(jìn)行優(yōu)化，顯著提高了系統(tǒng)對(duì)L1 mRNA的翻譯效

9、率，經(jīng)優(yōu)化后首次觀察到了系統(tǒng)中HPV58VLP的形成。因而該系統(tǒng)成為繼RRL系統(tǒng)后的第二個(gè)可進(jìn)行HPV L1病毒樣顆粒組裝的體外翻譯系統(tǒng)。我們進(jìn)一步利用該系統(tǒng)探索并揭示了導(dǎo)致長(zhǎng)短L1 mRNA翻譯差異的原因，并首次觀察到了HPV58長(zhǎng)短L1蛋白組裝的VLP顆粒。HPV/酵母體外翻譯系統(tǒng)具有的開(kāi)放性和高度可操作性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因而該系統(tǒng)有望用于1)研究HPV 58 L1蛋白在酵母中表達(dá)的影響因素，為提高L1蛋白表達(dá)產(chǎn)量、完善VLP酵母基因工

10、程疫苗的生產(chǎn)、開(kāi)發(fā)提供重要的借鑒；2)探討HPV VLP組裝的分子機(jī)制，為提高酵母中VLP形成效率，減少其與天然病毒顆粒的免疫原性差異等研究提供一個(gè)方便快捷的工具； 3)研究HPVDNA包裝的分子機(jī)制，為今后探討長(zhǎng)短L1蛋白包裝的病毒顆粒的感染力和感染機(jī)制的差異以及抗病毒新靶點(diǎn)的篩選等研究提供良好的平臺(tái)。目前，研究成果已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利一項(xiàng)(公示期)。同類研究尚未見(jiàn)報(bào)道。二、HPV6b L1基因在原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達(dá)研究為了檢測(cè)

11、基因密碼組成對(duì)L1基因在持續(xù)分化的角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的影響，我們用HPV6b野生型和優(yōu)化型的L1真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)一天的鼠角質(zhì)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的D3，D6，D9，D12分別收集鼠角質(zhì)細(xì)胞提取RNA和蛋白。對(duì)細(xì)胞固定后進(jìn)行免疫熒光染色后鏡下觀察。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提取的RNA樣品中L1基因的轉(zhuǎn)錄水平。Western Blot方法檢測(cè)L1蛋白的合成情況。 鏡下顯示：隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞顯示出明顯的逐步增強(qiáng)的細(xì)胞分化特征，免疫熒

12、光染色結(jié)果也顯示，角質(zhì)細(xì)胞終末分化的標(biāo)志性蛋白外皮蛋白(involucrin)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)也隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后角質(zhì)細(xì)胞可以持續(xù)轉(zhuǎn)錄野生和優(yōu)化型的L1 mRNA至少12天，而且優(yōu)化型的L1 mRNA的水平始終顯著高于野生型L1，這表明對(duì)GC結(jié)尾的密碼子進(jìn)行優(yōu)化可以促進(jìn)L1基因在KC細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。隨著細(xì)胞的分化，野生型和優(yōu)化型的L1基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著下降。Western Blot分析

13、顯示，野生型L1蛋白的表達(dá)隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；優(yōu)化型L1蛋白水平隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這表明L1 mRNA的密碼子成分組成是調(diào)節(jié)L1蛋白在KC細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)的一個(gè)重要因素；HPV L1蛋白的表達(dá)是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，同時(shí)與細(xì)胞的分化水平顯著相關(guān)。 甲硫氨酸標(biāo)記的L1蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，檢測(cè)到的L1蛋白的持續(xù)表達(dá)是由于L1蛋白的持續(xù)合成，Ll mRNA的密碼子組成是決定L1蛋白持續(xù)性合成的重要因素?？紤]到人角質(zhì)細(xì)

14、胞是HPV感染的天然宿主細(xì)胞，我們檢測(cè)了HPV6b L1真核表達(dá)質(zhì)粒在原代人角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。所得結(jié)果與鼠角質(zhì)細(xì)胞中的結(jié)果相似。 為了進(jìn)一步證實(shí)tRNA對(duì)L1的翻譯調(diào)控作用，我們檢測(cè)了不同分化程度的人或鼠KC中分離的aa-tRNA對(duì)體外翻譯系統(tǒng)中L1蛋白翻譯的影響。結(jié)果表明，野生型L1 mRNA傾向于在分化的鼠KC細(xì)胞制備的裂解物中進(jìn)行翻譯，而優(yōu)化型L1mRNA傾向于在低級(jí)分化的鼠KC細(xì)胞制備的裂解物中進(jìn)行翻譯。這一結(jié)果與L

15、1轉(zhuǎn)染的KC細(xì)胞中觀察到的野生和優(yōu)化L1蛋白的表達(dá)模式相同。這表明低級(jí)分化和完全分化的角質(zhì)細(xì)胞中的aa-tRNA組成不同，因而可以不同程度的吻合HPV野生和優(yōu)化型的L1 mRNA翻譯的需要，從而可以調(diào)節(jié)它們?cè)隗w外的翻譯水平。綜上所述，本研究中我們首次利用不同分化階段的人和鼠原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和體外翻譯系統(tǒng)進(jìn)行了L1蛋白翻譯調(diào)控機(jī)制的研究。研究中首次探索了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的角質(zhì)細(xì)胞中L1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)限，揭示了同義密碼子的替換效應(yīng)與細(xì)胞分