Apelin-13對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、心血管疾病已經(jīng)成為21世紀(jì)威脅人類健康的頭號殺手，其中最為兇險(xiǎn)的就是急性心肌梗死，發(fā)病率及致死率都很高。統(tǒng)計(jì)資料顯示，全球每年有1700萬人死于心血管疾病，其中一半以上死于急性心肌梗死。近十余年來隨著溶栓療法，PCI，冠狀動脈搭橋術(shù)等技術(shù)的進(jìn)步，血管疾病的再灌注治療得到了極為廣泛的應(yīng)用，使缺血心肌能夠重新獲得血液供應(yīng)，明顯減輕了心肌缺血性損傷，但急性心肌梗死死亡率仍很高，再灌注損傷是主要原因之一，可以導(dǎo)致心肌頓抑和心肌冬眠，嚴(yán)重可致無復(fù)

2、流，加重缺血心肌損害，導(dǎo)致大約25％心肌細(xì)胞壞死。因而急性心肌梗死在相關(guān)血管再通后，尋找切實(shí)有效的方法避免再灌注損傷，保護(hù)心肌，對改善患者的預(yù)后意義非常。 缺血再灌注損傷是復(fù)雜的過程，由多種因素共同參與包括氧自由基損傷、鈣超載、能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、ATP敏感性鉀通道及細(xì)胞凋亡等。細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的一個重要環(huán)節(jié)，深入研究并闡明其具體的機(jī)制對于缺血再灌注損傷的防治具有重要價值。 Apeli

3、n是1998年Tatemoto K等從牛胃勻漿中提取出來的含有77個氨基酸原前體肽，在體內(nèi)被分解為apelin-36，apelin-17，apelin-13及apelin-12等具有生物活性的多肽片段，是孤兒G-蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體。apelin及其受體APJ廣泛存在于心，腦，脂肪組織，肺，胃，骨骼肌及血管系統(tǒng)中，具有多種生理功能如降低血壓，調(diào)節(jié)飲食攝入，水鹽代謝及體液平衡，呼吸及生物節(jié)律而在心血管系統(tǒng)，下丘腦及脂肪胰島軸中的

4、作用最為重要。大量的早期研究集中在apelin及APJ在心臟及血管的分布及其mRNA的表達(dá)上，近幾年來，apelin在心血管系統(tǒng)中的作用受到廣泛關(guān)注。以往的研究表明apelin具有正性肌力及擴(kuò)張血管的作用，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)apelin在心衰，高血壓及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著一定的作用，推測apelin可能是一種內(nèi)源性的心血管保護(hù)物質(zhì)，那么apelin在心肌缺血再灌注損傷中的作用及作用機(jī)制如何，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道

5、較少。 本課題通過結(jié)扎在體大鼠冠狀動脈前降支來模擬急性心肌梗死病人的病理生理過程，研究apelin-13在急性心肌缺血再灌注損傷中的作用，以細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，探討其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其對線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial membrane permeabilitytransition pore，mPTP)的作用，為防治缺血再灌注損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及新的臨床應(yīng)用思路。 第一部分、Apelin-13對大鼠心

6、肌缺血再灌注損傷的影響 目的：通過建立在體大鼠急性心肌缺血再灌注模型，觀察apelin-13對心肌梗死面積，心肌細(xì)胞凋亡的影響 方法：取雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)，對照組(C組，n=9)，apelin-13組(A組，n=9)三組，S組只開胸置縫線而不結(jié)扎，C組與A組動物均開胸手術(shù)結(jié)扎左前降支，建立急性心肌缺血再灌注模型，缺血30分鐘，再灌注120分鐘，再灌注前5分鐘分別頸靜脈內(nèi)注射生理鹽水及apelin-1

7、3，其中6只大鼠再灌注結(jié)束后予Evan'sblue左室腔內(nèi)注射，處死大鼠，取出心臟，TTC染色后測定心肌相對梗死面積(梗死面積占缺血危險(xiǎn)區(qū)的百分比)。另3只大鼠取心臟標(biāo)本制成石蠟切片后用TUNEL方法測定心肌細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：Apelin-13能夠縮小心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡。對照組相對梗死面積為53.03±8.90％，apelin-13組梗死面積為34.73±7.20％，較對照組明顯減少。apelin-13組和contr

8、ol組均可見到凋亡的陽性細(xì)胞，兩組凋亡指數(shù)分別為0.21±0.02和0.31±0.05，apelin-13組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少。 結(jié)論：再灌注時給予apelin-13可抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、減少缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積，具有心肌保護(hù)作用。 第二部分、Apelin-13對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制的研究 目的：探討apelin-13對大鼠缺血再灌注心肌保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制，是否通過激活P

9、I3K/Akt及ERK1/2途徑作用于GSK-3β，及對線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的影響。 方法：取雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)，對照組(C組，n=6)，apelin-13組(A組，n=6)，apelin-13+LY294002組(AL組，n=5)，apelin-13+PD98059組(AP組，n=5)，apelin-13+atractyloside組(AA組，n=5)，SB216763組(SB組，n=5)，LY2

10、94002組(LY組，n=5)，PD98059組(PD組，n=5)，Atractyloside組(AT組，n=5)建立急性心肌缺血再灌注模型，缺血及再灌注時間同前述，再灌注120min結(jié)束后，取出心臟，Evan's blue及TTC雙重染色后，數(shù)碼相機(jī)拍照，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定心肌梗死相對面積。另取SD雄性大鼠隨機(jī)分為SO組(n=3)，C組(n=3)，A組(n=3)，AL組(n=3)，AP組(n=3)，建立缺血再灌注模型，缺血30分鐘

11、，再灌注10分鐘，給藥方法同前，再灌注結(jié)束后取出心臟，Western blot方法檢測Akt，ERK1/2，GSK-3β及其磷酸化蛋白水平。體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為H2O2組，H2O2+apelin-13組，H2O2+SB216763組，缺氧/復(fù)氧組，缺氧/復(fù)氧+apelin-13組，缺氧時間10min，復(fù)氧時間20min，TMRE負(fù)載心肌細(xì)胞，37℃孵育20min，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位變化。 結(jié)果：①Ap

12、elin-13使心肌梗死面積減少約19％，SB組梗死面積較對照組明顯減少，AL組，AP組及AA組相對梗死面積與對照組相比無顯著差異，說明Apelin-13與SB216763均可以減少心肌梗死面積，預(yù)先應(yīng)用LY294002，PD98059及atractyloside后apelin-13的這種作用被取消，同時，單純給予LY294002，PD98059及atractyloside這三種藥物組梗死面積與對照組相比無差異，說明這三種藥物本身對梗死

13、面積無影響。②Apelin-13使p-Akt，p-ERK1/2，p—GSK-3β表達(dá)顯著增加，預(yù)先給予LY294002及PD98059后p-GSK-3β表達(dá)增加的作用消失。③H2O2+apelin-13組及H2O2+SB216763組TMRE熒光強(qiáng)度下降均較H2O2組顯著減少，缺氧/復(fù)氧+apelin-13組TMRE熒光強(qiáng)度下降較缺氧/復(fù)氧組顯著減少，說明Apelin-13與SB216763均可以使氧化應(yīng)激及缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞線粒