膀胱癌和乳腺癌相關(guān)分子標志物的研究.pdf

1、這一關(guān)于惡性腫瘤分子標志物的研究課題由相對獨立的兩部分工作構(gòu)成。
　　 第一部分:以DNA拷貝數(shù)異常改變作為膀胱癌診斷相關(guān)分子標志物的研究
　　 膀胱癌在發(fā)生發(fā)展過程中常見基因組DNA結(jié)構(gòu)的異常改變，這些分子遺傳學(xué)改變既可以為膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究指引方向，也能夠為膀胱癌相關(guān)分子標志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供信息。本實驗室的前期工作采用array CGH(arraycomparative genome hybridizat

2、ion)技術(shù)對膀胱尿路上皮癌組織進行分析，初步獲得了膀胱癌特征性DNA拷貝數(shù)變化譜型。為了將這組通過高通量技術(shù)獲得的膀胱癌相關(guān)分子遺傳學(xué)改變的研究結(jié)果進行可能的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，本課題將上述膀胱癌特征性DNA拷貝數(shù)異常改變的檢測手段從array CGH技術(shù)平臺過渡到實時定量PCR(real time PCR)技術(shù)平臺。經(jīng)過對array CGH實驗數(shù)據(jù)再挖掘、候選DNA片段/基因篩選與驗證，旨在獲得一組具有臨床應(yīng)用前景的膀胱癌診斷相關(guān)DNA分

3、子標志。
　　 采用生物信息學(xué)方法，通過對前期array CGH實驗的數(shù)據(jù)再挖掘，將芯片上基因/區(qū)段拷貝數(shù)改變按發(fā)生頻率進行排序，首先挑選出DNA拷貝數(shù)改變頻率最高的、將用于本項研究Real-time PCR分析驗證的11個候選基因(A_14_ P139169、CEP63、CLK1、FOSL2、GHR、LILRA3、PAQR6、PARVA、SFRS8、ZFAND3、ZNF76)，以及無拷貝數(shù)改變的2個基因（TBP和TMEM39A

4、）作為Real-time PCR分析內(nèi)參。
　　 通過對array CGH實驗分析過的56例膀胱癌“起始”樣品進行Real-time PCR檢測，以“跨技術(shù)平臺核查”的方式，從上述11個候選基因中篩選出5個(CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6和ZFAND3)候選目的基因用于后續(xù)驗證。5個候選目的基因的驗證在3組獨立樣本中進行:分別為58例開放性手術(shù)切除的膀胱癌凍存組織、62例甲醛固定石蠟包埋(FFPE)膀胱癌組織和43例

5、經(jīng)尿道切除(TURBT)膀胱癌組織。
　　 結(jié)果顯示，與對照組30例正常人外周血白細胞基因組DNA比較，CEP63和PAQR6兩個基因在全部3組膀胱癌組織樣本中均出現(xiàn)拷貝數(shù)增加的趨勢，其差別具有顯著性;而FOSL2和GHR基因拷貝數(shù)增加只出現(xiàn)在“FFPE”樣本中;ZFAND3基因的拷貝數(shù)顯著減少可見于“FFPE”樣本和“TURBT”樣本。值得注意的是，與正常對照組相比，“FFPE”樣本中5個候選目的基因均顯示了與芯片結(jié)果趨勢一致

6、的顯著性拷貝數(shù)改變。并且，這種改變從正常對照到非浸潤性再到浸潤性膀胱癌組織中有漸進性的趨勢，尤其以CEP63、PAQR6和ZFAND3表現(xiàn)明顯。以膀胱癌組織驗證結(jié)果為基礎(chǔ)，進一步分析了這5個基因在膀胱癌患者尿脫落細胞中的拷貝數(shù)改變。與對照組患者尿脫落細胞DNA樣品相比，PAQR6和FOSL2基因在膀胱癌病例組中拷貝數(shù)顯著增加，結(jié)果與array CGH芯片分析結(jié)果一致;但是ROC曲線分析其診斷效能尚不足。
　　 上述研究資料表明，

7、膀胱癌中PAQR6和CEP63等基因的拷貝數(shù)改變是在膀胱尿路上皮癌病變組織基因組DNA中的大概率分子事件;這些具有統(tǒng)計學(xué)意義的DNA分子改變可在膀胱癌患者尿脫落細胞中檢出。若將這些異常改變轉(zhuǎn)化為膀胱癌診斷相關(guān)分子標志物，還有待于進一步的縝密分析和大樣本多中心驗證。
　　 第二部分:乳腺癌新輔助化療組織病理學(xué)治療反應(yīng)相關(guān)分子標志物的研究
　　 新輔助化療已成為針對局部進展期的乳腺癌綜合治療中的重要環(huán)節(jié);治療后達到組織病理學(xué)

8、完全緩解的患者可長期生存。腫瘤對化療的反應(yīng)性是選擇治療方案最重要的依據(jù)。傳統(tǒng)的病理類型、病理分級等形態(tài)學(xué)指標尚不足以全面有效地評估新輔助化療后的組織病理學(xué)治療反應(yīng);相關(guān)分子標志表達譜對于準確預(yù)測新輔助化療后的組織病理學(xué)治療反應(yīng)具有重要的輔助意義。
　　 本項研究選擇近年報道的與乳腺癌新輔助化療組織病理學(xué)治療反應(yīng)有關(guān)的蛋白分子CK5/6、EGFR、cyclin B1、14-3-3σ、14-3-3ξ，結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)分子標志物ER、P

9、R、HER2，聯(lián)合檢測這8個蛋白在新輔助化療前乳腺癌核芯針穿刺活檢組織中的表達情況。對215例浸潤性乳腺癌新輔助化療前的活檢穿刺獲得的甲醛固定石蠟包埋組織切片進行這8個蛋白的免疫組化染色。收集入組患者手術(shù)切除腫瘤組織，進行組織病理學(xué)治療反應(yīng)的MP分級（Miller&Payne病理分級）。統(tǒng)計分析患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、臨床分期、病理分級、病理類型，以及上述8個蛋白表達與MP分級的關(guān)系。將結(jié)果進行Logistic回歸分析，建立分子聯(lián)合檢測模型

10、，并繪制ROC曲線;分析候選蛋白分子標志物評估/預(yù)測乳腺癌新輔助化療組織病理學(xué)反應(yīng)的效能。
　　 研究結(jié)果顯示，8個候選蛋白在215例乳腺癌患者新輔助化療前核芯針穿刺活檢的腫瘤組織中的陽性表達率分別為: ER42.8％、PR42.8％、HER234.0％、CK5/627.9％、EGFR55.8％、cyclin B147.9％、14-3-3σ28.8％、14-3-3ξ79.5％。HER2主要表達于絕經(jīng)后組中，與絕經(jīng)前組比較，其表達

11、差別具有顯著性。ER、PR同步表達，并主要表達于分化較好的腫瘤組織中。而CK5/6主要表達于分化較差的腫瘤組織中。與MP分級（有效/無效）顯著相關(guān)的病理特征只有組織學(xué)分級。蛋白分子標志物之中，ER、PR、CK5/6、EGFR、14-3-3σ在MP有效組和無效組之間的表達具有顯著性差異，其P值分別為ER(P＜0.001)、PR(P=0.001)、CK5/6(P＜0.001)、EGFR(P=0.024)、14-3-3σ(P=0.017)。經(jīng)