NFAT5在海水淹溺性肺損傷中作用機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　海水淹溺是航海作業(yè)環(huán)境常見的意外事故,也是軍隊海上作戰(zhàn)戰(zhàn)斗減員的主要原因之一。人體吸入海水后,引起肺順應性改變、海水淹溺型肺水腫、肺內(nèi)分流、低氧血癥及酸中毒,若不及時處理可導致全身臟器不可逆的損害。其中海水淹溺后造成的肺水腫(pulmonary edema induced by seawater drowning,PE-SWD)和炎癥,經(jīng)過海水淹溺型急性肺損傷(seawater aspiration induced

2、 acute lung injury,SWD-ALI)階段進一步發(fā)展為海水淹溺型急性呼吸窘迫綜合征(seawater aspiration induced acute respiratory distress syndrome,SWD-ARDS),救治起來極為困難,病死率極高。有研究報道,NFAT5是哺乳動物體內(nèi)唯一已知的滲透壓轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子,高滲可以導致細胞皺縮,線粒體去極化,DNA損傷,最終造成細胞凋亡,NFAT5則是負責在這種條件下

3、維持細胞內(nèi)外滲透壓的平衡。最近研究表明,NFAT5通過刺激前炎因子的表達,在炎癥疾病中扮演著重要的角色?，F(xiàn)廣泛報道的海水淹溺型肺損傷的發(fā)病機制并不完善,治療也具有一定的限制性,效果并不十分理想。因此,正確認識海水淹溺導致肺損傷的機理是及時有效治療海水吸入所致急性肺損傷的基礎(chǔ),對海水淹溺型肺損傷發(fā)病機制的進一步研究具有十分重要的臨床指導意義。本課題結(jié)合海水本身的高滲特征和肺損傷發(fā)病的普遍機理,致力于找到海水這一特殊液體引起急性肺損傷的具體

4、發(fā)病機制。
　　實驗目的:
　　本實驗研究了NFAT5在海水淹溺型肺損傷中所扮演的重要角色,通過復制SWD-ALI大鼠模型,觀察NFAT5及有機滲透物質(zhì)在海水淹溺發(fā)生后表達的變化,以及其對山梨醇轉(zhuǎn)運蛋白,?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白,醛糖還原酶等有機滲透物質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控,探討NFAT5在海水淹溺型肺損傷發(fā)生后對肺水腫的減輕機制。并探索NFAT5在海水淹溺發(fā)生后炎癥環(huán)節(jié)中,所扮演的重要角色。
　　實驗方法:
　　體內(nèi)實驗:

5、r>　　復制SD大鼠海水淹溺肺損傷模型,將56只180-200gSD大鼠隨機分為7組,對照組,海水淹溺1h組,2h組,3h組,4h組,5h組,6h組,每組8只。按1ml/kg給予大鼠3％戊巴比妥鈉進行麻醉后,經(jīng)氣管注入新鮮配制海水(4ml/kg)。根據(jù)不同時間點的選擇,處死動物后,取左下肺組織行HE染色,觀察病理變化。右下肺組織稱重,烘干,進行濕/干比值的檢測。大鼠處死后的肺組織分塊并保存于-80°C冰箱,分別用于ELISA檢測炎癥因子

6、變化,Western Blot、免疫組化檢測NFAT5蛋白含量變化,實時定量PCR在mRNA水平檢測NFAT5及滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的變化,有機滲透物質(zhì)如山梨醇、牛磺酸、甜菜堿變化,由液相質(zhì)譜聯(lián)用法進行檢測。
　　體外實驗:
　　A549細胞的培養(yǎng)及處理:使用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細胞,在進行海水干預前行MTT試驗,向培養(yǎng)液中加入不同比例海水,觀察不同濃度海水對細胞的抑制率,選擇合適濃度進行實驗。(1)觀察不同滲透

7、壓對A549細胞的影響:選擇20%,30%,40%,50%濃度梯度海水干預細胞,培養(yǎng)6h,行Western Blot及實時定量PCR觀察細胞NFAT5在蛋白及mRNA水平的變化。(2)觀察不同海水干預時間對A549細胞的影響:選擇30%濃度海水,分為4h,6h,8h,10h,12h組,行WesternBlot及實時定量PCR觀察細胞NFAT5在蛋白及mRNA水平的變化。(3)ELISA檢測不同滲透壓及時間對A549細胞進行干預后IL-6

8、,IL-1β,TNF-α在細胞上清液中的變化。
　　實驗結(jié)果:
　　體內(nèi)實驗:
　　大鼠注入海水后,肺組織W/D,ELI較對照組顯著增加(p<0.01),高滲刺激后滲透壓保護基因NFAT5蛋白及mRNA表達量增加,同時,有機滲透物質(zhì)和滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白含量也隨NFAT5的增加而增加。隨時間的變化,肺水腫程度減輕。根據(jù)ELISA,HE染色,實時定量PCR結(jié)果,發(fā)現(xiàn)炎癥反應在4h時開始加重。
　　體外實驗:
　

9、　通過Westernblot和qRT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)隨滲透壓的升高及培養(yǎng)時間的延長,NFAT5及滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白表達量均增加。ELISA結(jié)果顯示,隨NFAT5的升高,IL-6,IL-1β,TNF-α前炎因子的生成量增多。
　　實驗結(jié)論:
　　NFAT5在海水淹溺型肺損傷的發(fā)生機制中發(fā)揮著重要作用,在肺水腫發(fā)生過程中,NFAT5通過對SMIT、BGT1、AR等滲透壓相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控,致使山梨醇,?；撬?甜菜堿等有機滲透物