鴿Toll樣受體7基因的克隆及其免疫生物學(xué)功能研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原體入侵的首道防線。病原微生物感染后，機(jī)體細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(Pattern-recognition receptors，PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，然后激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性因子和Ⅰ型干擾素的表達(dá)。Toll樣受體7(Toll-like receptor7，TLR7)位于細(xì)胞的內(nèi)體上，能識(shí)別病毒的單鏈RNA及咪唑

2、喹啉類成分，并誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，在抗病毒感染中具有重要作用。相較于哺乳動(dòng)物TLR7，禽類TLR7的序列特征和生物功能還研究較少，目前主要集中在雞、鴨和鵝等水陸禽類中，而飛禽如鴿TLR7的研究至今還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在克隆和分析鴿TLR7的基因序列，挖掘其關(guān)鍵的配體識(shí)別位點(diǎn)，并探索其在天然免疫應(yīng)答中的功能，從而為進(jìn)一步研究鴿TLR7的結(jié)構(gòu)特征和生物功能以及禽類的天然免疫積累理論依據(jù)。
　　1.鴿TLR7基因的克隆、序列分析及其表達(dá)譜

3、檢測(cè)
　　本研究根據(jù)禽類TLR7基因的保守序列設(shè)計(jì)出特異性引物，首次從大王鴿克隆TLR7基因。利用生物信息學(xué)軟件分析其序列特征，鴿TLR7基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?144 bp，編碼1047個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明其是一類典型的TLR，由N端的一個(gè)信號(hào)肽序列、15個(gè)LRR重復(fù)序列、一個(gè)LRR-CT和胞內(nèi)TIR區(qū)組成。蛋白相互作用空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明兩個(gè)TLR7的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域形成典型的“m”形二聚體。糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明鴿TLR7含有1

4、8個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)和38個(gè)磷酸化位點(diǎn)。鴿TLR7氨基酸序列與人、鼠、雞、鴨TLR7的同源性分別為65.0％、62.2％、81.5％和83.8％。通過(guò)RT-PCR分析鴿不同組織中TLR7基因的表達(dá)差異，結(jié)果表明鴿TLR7在免疫相關(guān)組織尤其是脾臟和肝臟中具有較高的表達(dá)水平。
　　2.鴿TLR7的免疫生物學(xué)功能及其配體識(shí)別位點(diǎn)的挖掘
　　構(gòu)建含有鴿TLR7的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-PiTLR7，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，Wes

5、ternblotting鑒定了TLR7的表達(dá)。利用NF-κB熒光素酶報(bào)告載體，在R848配體刺激后，鴿TLR7能夠顯著地介導(dǎo)NF-κB的活化，表明鴿TLR7是一類有功能的TLR。對(duì)鴿TLR7 LRR序列進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)LRR2、LRR11、LRR13和LRR14的第15位以及LRR10的第10位均存在氨基酸的插入修飾，于是我們通過(guò)overlap-PCR的方法分別構(gòu)建了這些位點(diǎn)缺失的TLR7突變體，并連接到pCMV真核表達(dá)載體上。利用NF

6、-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，結(jié)果顯示這些插入序列的缺失完全廢除了TLR7介導(dǎo)的NF-κB的活化，表明非經(jīng)典LRR序列是TLR7發(fā)揮功能所必需的，這些序列可能是TLR7識(shí)別配體的關(guān)鍵位點(diǎn)。此外，通過(guò)qRT-PCR和ELISA方法檢測(cè)了TLR7和細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果表明TLR7突變體均不能介導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生，這與NF-κB活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的;然而部分突變體(Del10IN10和De114IN15)可介導(dǎo)IFN-α和TNF-α的產(chǎn)生，同時(shí)，

7、R848刺激后，鴿TLR7突變體的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)，表明鴿TLR7突變體通過(guò)增加其表達(dá)量進(jìn)而代償其功能的缺陷。然而，鴿TLR7 Del11IN15突變體盡管增加了其自身的表達(dá)量，仍不能有效地誘導(dǎo)IFN-α、IL-8和TNF-α的產(chǎn)生，表明關(guān)鍵LRR插入序列的缺失會(huì)導(dǎo)致假代償?shù)某霈F(xiàn)。
　　3.鴿TLR7介導(dǎo)激動(dòng)劑及新城疫病毒感染的天然免疫應(yīng)答研究
　　通過(guò)R848刺激鴿外周血單核細(xì)胞，應(yīng)用熒光定量PCR的方法檢測(cè)TL

8、R7、IFN-γ、IL-6、IL-8、CCL5和IL-10的mRNA水平，結(jié)果表明R848刺激12h和24 h后前炎性細(xì)胞因子和相關(guān)抗病毒分子均顯著上調(diào)，而TLR7的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。分別使用新城疫LaSota疫苗株和R848激動(dòng)劑肌肉注射大王鴿，通過(guò)qRT-PCR的方法檢測(cè)了脾臟中TLR7及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果表明R848肌肉注射組中TLR7的mRNA水平顯著升高，LaSota感染組TLR7的表達(dá)在第三天時(shí)顯著降低，而前炎性細(xì)