豬ADFP基因的克隆、染色體定位及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、脂肪分化相關(guān)蛋白(ADFP)是一種細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚及與脂肪細(xì)胞積聚相關(guān)疾病的靈敏而特異的指標(biāo)。它在未分化的脂肪細(xì)胞中含量很低，在分化過程中急劇增加，而分化成熟后又逐漸被perilipin所代替。ADFP定位于脂滴表面，是脂滴結(jié)合蛋白PAT(Perilinpin，ADFP,TIP47)家族中的一員。豬ADFP的人類同源蛋白稱為親脂素(adipophilin)，它不僅參與脂質(zhì)代謝，刺激脂質(zhì)的聚集和脂滴的形成，而且在動(dòng)脈粥樣硬化，2型糖尿病的發(fā)

2、生、發(fā)展中也可能起作用，因此已經(jīng)引起研究者們的關(guān)注。 本文以豬為研究對(duì)象，從分子和細(xì)胞水平上對(duì)ADFP進(jìn)行了基因克隆、染色體定位、組織分布及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。首先通過RT-PCR擴(kuò)增獲得ADFP1380bp的全長cDNA編碼區(qū)及719bpC端非保守區(qū)，編碼區(qū)核苷酸序列與已公布的豬cDNA序列享有99.4％的同源性，氨基酸序列則有4個(gè)氨基酸的不同。另外，與人、小鼠、大鼠、狗和牛ADFP分別享有85.9，76.8，75.2，86.8和8

3、2.7％的同源。證明ADFP具有很強(qiáng)的保守性，預(yù)示著其重要的生理作用。C端非保守區(qū)719-bpcDNA用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI消化后用以構(gòu)建pGEX-ADFP-C表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL21(ED3)中進(jìn)行表達(dá)，得到具有免疫特異性的融合蛋白ADFP-GST，經(jīng)SDS-PAGE和WB鑒定后，進(jìn)行純化并定量，作為抗原免疫新西蘭白兔，獲得兔抗豬抗血清；其二，根據(jù)人和小鼠基因結(jié)構(gòu)以及與豬序列的同源性，設(shè)計(jì)特異引物，獲得梅山豬第4、第5和第

4、7內(nèi)含子，與韓國本土豬ADFP基因結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，梅山豬在第4內(nèi)含子上發(fā)生了276bp的SINE的缺失；另外第7內(nèi)含子上還存在一個(gè)SINE，這些SINE，尤其是缺失的SINE，可作為一種很有價(jià)值的時(shí)間標(biāo)志，鑒定不同品系之間的進(jìn)化關(guān)系；其三，應(yīng)用輻射雜種細(xì)胞系技術(shù)將豬ADFP基因定位于1q21-q27，該結(jié)果與人豬比較圖譜相一致；其四，通過RT半定量PCR，檢測了豬9個(gè)組織ADFPmRNA水平上的組織分布和相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示腦和脂肪組織的