低氧對大鼠肺動脈平滑肌細胞巢蛋白表達的影響及紫草素的干預作用.pdf

1、目的:
　　1.通過RNA干擾(RNAi)技術下調巢蛋白表達，探討其對肺動脈平滑肌細胞增殖的影響研究。
　　2.低氧對大鼠肺動脈平滑肌細胞巢蛋白表達的影響。
　　3.研究紫草素(Shikonin)對低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的干預作用及其作用機制。
　　方法:
　　采用酶消化法獲得大鼠肺動脈平滑肌細胞，使用細胞免疫化學染色法鑒定細胞及純度，0.4％臺盼藍染色行活細胞計數(shù)。設計合成針對大鼠Nestin基因的

2、特異性siRNA片段，與大鼠Nestin基因序列無同源性的siRNA-con片段為陰性對照。將上述2個片段通過陽離子脂質法轉染PASMCs內，通過逆轉錄PCR及Western-Blot分別檢測mRNA及蛋白水平的干擾效率，采用CCK-8染色法檢測空白對照組(Blank)，陰性轉染組(siRNA-con)及Nestin基因特異性沉默組(siRNA)各組PASMCs的活性，以檢測的吸光度(Absorbance，A)值大小作為細胞相對數(shù)量的比

3、較。采用CCK-8染色法測定常氧和24小時低氧情況下PASMCs的活性，及不同濃度紫草素（S，shikonin，1μM，2μM，4μM）對低氧PASMCs活性的抑制，并選擇合適濃度。把大鼠肺動脈平滑肌細胞分成3組:正常對照組(N)，24h低氧組(H)，24h低氧+紫草素組(S，紫草素終濃度:4μM)。每次實驗前均用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓48小時使細胞同步化，實驗重復3次。采用逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測各組細胞Nestin mRN

4、A表達;Western-Blot法檢測Nestin蛋白表達變化。
　　結果:
　　1.逆轉錄PCR及Westem-Blot顯示，Blank組與siRNA-con組比較，在mRNA及蛋白水平上Nestin的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;與Blank組及siRNA-con組比較，RNAi實驗組中Nestin mRNA及蛋白含量下降，有顯著性差異（P＜0.01）。
　　2.siRNA-con組較Blank組CCK-

5、8的A值稍下降，但未達到統(tǒng)計學意義(P＞0.05);RNAi實驗組較Blank組及siRNA-con組CCK-8的A值顯著下降(P＜0.01)。
　　3.與常氧PASMCs比較，24h低氧情況下PASMCs CCK-8的A值顯著升高(P＜0.01);紫草素濃度為1μM、2μM時，低氧PASMCs的A值開始下降，但未達到統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;當紫草素濃度為4μM時，對細胞活性的抑制率達19.8％，A值接近于正常值。
　　

6、4.低氧使PASMCs Nestin mRNA及蛋白表達量升高，與常氧組比較均具有顯著差異(P＜0.01)。
　　5.在低氧狀態(tài)下，加紫草素組PASMCs Nestin mRNA及蛋白含量下降，與低氧組比較有顯著性差異（P＜0.05）。
　　結論:
　　1.RNAi技術能下調大鼠肺動脈平滑肌細胞Nestin表達水平;Nestin具有促進肺動脈平滑肌細胞增殖作用。
　　2.低氧可通過上調Nestin的表達促進大鼠肺