紅景天苷抑制小鼠低氧性肺動脈平滑肌細胞增殖的研究.pdf

1、目的:肺動脈高壓是慢性阻塞性肺疾病發(fā)展為肺心病的重要環(huán)節(jié)，形成持續(xù)性肺動脈高壓的主要原因為肺血管重構(gòu)(Pulmonary vessel structural remodeling，PVSR)。肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）是PVSR的重要效應(yīng)細胞，抑制PASMCs增殖對防治肺動脈高壓具有重要意義。本實驗室先期在體實驗發(fā)現(xiàn)紅景天苷對大鼠低氧性肺動脈高壓、肺血管

2、重建具有抑制作用，可能是通過提高A2AR的表達實現(xiàn)的。本實驗采取離體細胞培養(yǎng)技術(shù)，以與人類有較大的基因同源性的小鼠為研究對象，觀察紅景天苷對小鼠低氧性肺動脈平滑肌細胞增殖的作用，并初步探討其作用機制。
　　方法:本實驗以離體培養(yǎng)的野生BALB/c小鼠PASMCs為研究對象。將肺動脈從小鼠肺中剝離后，用Ⅰ型膠原酶消化法獲得原代肺動脈平滑肌細胞。細胞培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，氣體條件為5％CO2，21％O2，74％N2。用免疫化學(xué)染色

3、法和免疫熒光染色法鑒定小鼠PASMCs并確定純度。實驗共分4組:正常對照(control，C)組、低氧(hypoxia，H)組、H+CGS（A2AR選擇性激動劑）組、H+紅景天苷(Salidroside，Sal)組。所有低氧組均在低氧培養(yǎng)箱中按照5％CO2，5％O2，90％N2的條件，37℃培養(yǎng)24小時。用細胞計數(shù)試劑盒8（Cell counting kit-8，CCK-8）檢測各組PASMCs增殖活力情況，測得的吸光度(absorba

4、nce，A)值作為相對的細胞數(shù)量來進行比較。熒光實時定量PCR(Real Time PCR)檢測各組PASMCs A2AR mRNA的表達水平，每次實驗設(shè)置3個復(fù)孔，測得CT值后取平均值，重復(fù)三次實驗后用統(tǒng)計軟件分析。蛋白印跡（Western Blott，WB）技術(shù)檢測各組PASMCs A2AR蛋白的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.免疫化學(xué)染色后，高倍鏡下觀察培養(yǎng)的細胞，可見單個細胞胞漿被染為棕黃色，胞質(zhì)中可見絲狀物，為平滑

5、肌特有的α-肌動蛋白，提示為肺動脈平滑肌細胞。同時免疫熒光結(jié)果進一步顯示，高倍鏡下可見單個梭形細胞，胞質(zhì)含有大片散發(fā)綠色熒光的絲狀物，均勻分布，為平滑肌α-肌動蛋白，顯示藍色熒光的是DAPI標記的細胞核。低倍鏡下可看到大量顯示綠色熒光的肌絲，以及顯示藍色熒光的細胞核。綜上所述，培養(yǎng)的細胞確為肺動脈平滑肌細胞。
　　2.低氧組CCK-8的吸光度A值為0.81±0.03，較正常對照組（A值為0.72±0.03）升高(P＜0.01)，表

6、明低氧情況下PASMCs增殖。
　　3.H+CGS組的CCK-8吸光度（0.72±0.02）較低氧組（0.81±0.03）明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01），提示CGS可抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖。
　　4.H+ Sal組的CCK-8吸光度（0.73±0.04）較低氧組（0.81±0.03）明顯降低P＜0.01)，提示紅景天苷可抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖。
　　5.A2AR mRNA和蛋白表達量，低氧組

7、較對照組明顯升高(P＜0.05)，提示低氧情況下，A2AR表達可能代償性增加。
　　6.H+CGS組A2AR mRNA和蛋白表達量較低氧組明顯升高（P＜0.05），提示CGS可能促進A2AR表達;H+ Sal組A2AR mRNA和蛋白表達量較低氧組明顯升高(P＜0.05)，提示紅景天苷干預(yù)后，A2AR表達增加，進一步提高了機體的代償能力。
　　結(jié)論:紅景天苷對小鼠離體低氧性肺動脈平滑肌細胞增殖具有抑制作用，紅景天苷上調(diào)A2A