腺病毒介導(dǎo)Gax基因轉(zhuǎn)染對(duì)低氧性大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景和目的： 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，并從中膜遷移于內(nèi)膜大量增殖，是低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)肺血管結(jié)構(gòu)重建(PVSR)的基本病理變化。PASMCs的增殖加速和凋亡減慢可以視為PVSR血管內(nèi)膜過度增生的演變核心。以PASMCs增殖和凋亡為切入點(diǎn)，探討HPH的發(fā)病機(jī)制，尋求HPH有效防治策略已成為目前研究前沿的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。 有關(guān)生長因子、生長因子受體及其信號(hào)傳導(dǎo)通路在PASMCs的生物學(xué)行

2、為異常中的作用研究較為深入。但關(guān)于核轉(zhuǎn)錄因子如何將這些信號(hào)進(jìn)行整合并啟動(dòng)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)反應(yīng)的研究尚欠缺。Gax基因是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的核轉(zhuǎn)錄因子基因之一。研究證實(shí)Gax(growth-arresthomeobox)基因是一個(gè)主要存在于心血管系統(tǒng)的同源盒基因，同源盒基因在胚胎發(fā)育中調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和遷移。增強(qiáng)Gax基因表達(dá)可以抑制心血管平滑肌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。以往的研究側(cè)重于Gax基因在心血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋

3、亡中的作用，而有關(guān)Gax基因在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的作用研究，目前亦尚欠缺。此外，研究側(cè)重于Gax基因?qū)ρ芷交≡鲋车挠绊?，?duì)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究亦顯不足。鑒于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞與心血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性具有相似性，我們推測(cè)增強(qiáng)Gax基因表達(dá)對(duì)低氧性PASMCs可能也有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)首先觀察正常大鼠PASMCs中是否有Gax基因表達(dá)，以及低氧對(duì)PASMCs中Gax基因表達(dá)是否有影響；其次通過攜帶Gax基

4、因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠PASMCs，觀察增強(qiáng)Gax基因表達(dá)對(duì)常氧和低氧條件下PASMCs增殖和凋亡的影響，以及原癌基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討Gax基因在低氧性PASMCs增殖和凋亡中的作用和機(jī)制。 方法： 1.采用組織塊貼壁法，顯微鏡觀察和α-SM-actin免疫細(xì)胞化學(xué)方法原代培養(yǎng)和鑒定大鼠PASMCs。 2.TR-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot法檢測(cè)常氧和低氧條件下PASM

5、Cs中GaxmRNA和蛋白表達(dá)的變化。 3.用293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞擴(kuò)增、氯化銫梯度離心純化、空斑形成實(shí)驗(yàn)、PCR、RT-PCR和Westemblot鑒定攜帶大鼠Gax基因表達(dá)序列的重組腺病毒載體(Ad-Gax)及觀察其表達(dá)，制備高效、高滴度的病毒轉(zhuǎn)染液。 4.以病毒轉(zhuǎn)染液常規(guī)轉(zhuǎn)染PASMCs后，應(yīng)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別檢測(cè)Gax基因在常氧和低氧條件下PASMCs轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)。 5.應(yīng)用四唑

6、鹽(MTT)比色試驗(yàn)、3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、電鏡和TUNEL染色觀察Gax基因表達(dá)增強(qiáng)對(duì)在常氧和低氧條件時(shí)PASMCs增殖、和凋亡的影響。 6.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和RT-PCR技術(shù)，在常氧和低氧條件下，分別觀察Gax基因轉(zhuǎn)染前后PASMCs中與增殖相關(guān)的原癌基因(c-fos、c-jun)以及與凋亡相關(guān)的凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2)表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)

7、和α-SM-actin免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定，應(yīng)用大鼠肺動(dòng)脈原代培養(yǎng)所得細(xì)胞正是預(yù)期的PASMCs?？梢杂糜谶M(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 2.在常氧和低氧條件下，用TR-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot法均檢測(cè)到PASMCs中有GaxmRNA和蛋白的表達(dá)。低氧可以下調(diào)Gax基因在PASMCs中的表達(dá)水平，并且隨著低氧時(shí)間的延長，Gax基因表達(dá)下降程度更加顯著。 3.成功地?cái)U(kuò)增、純化和鑒定了攜帶大鼠Gax基因表達(dá)序列的重組腺病

8、毒載體，并純化制備高效高滴度病毒轉(zhuǎn)染液。獲得70μl純化病毒液，滴度高達(dá)1.0×1010-3.6×1011pfu/ml，最佳感染復(fù)數(shù)為80的Ad-Gax轉(zhuǎn)染液。Ad-Gax轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后出現(xiàn)Gax基因高表達(dá)，提示Ad-Gax可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色均顯示Ad-Gax轉(zhuǎn)染PASMCs后，PASMCs的Gax蛋白表達(dá)率明顯增高，轉(zhuǎn)染后12小時(shí)即可超過80％，高水平的表達(dá)可維持較長時(shí)間。

9、 5.Ad-Gax轉(zhuǎn)染后，Gax基因在PASMCs中能夠高效過表達(dá)。增強(qiáng)PASMCs中Gax基因的表達(dá)后，無論有無低氧刺激，PASMCs中Gax基因的表達(dá)均比轉(zhuǎn)染前顯著增加(P＜0.01)。 6.Ad-Gax轉(zhuǎn)染使PASMCs中表達(dá)Gax增強(qiáng)后，PASMCs中的MTT吸光度值和3H-TdR摻入量均較未轉(zhuǎn)染組顯著降低，PASMCs中G0/G1比例較未轉(zhuǎn)染組顯著增高(P＜0.01)，S+G2/M比例顯著降低(P＜0.01)。

10、 7.在低氧條件下Ad-Gax轉(zhuǎn)染使PASMCs中的c-fos、c-junmRNA表達(dá)比未轉(zhuǎn)染組顯著降低(P＜0.01)。 8.無Ad-Gax轉(zhuǎn)染時(shí)，低氧刺激前后，均無或可見極少量的TUNEL染色陽性細(xì)胞；Ad-Gax轉(zhuǎn)染后，如無低氧刺激，也無或僅可見少量的TUNEL染色陽性細(xì)胞，予低氧刺激后，TUNEL染色陽性細(xì)胞顯著增多，尤其在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)至48小時(shí)更明顯。 9.Ad-Gax轉(zhuǎn)染前，與常氧時(shí)比較，低氧刺激PASMC

11、s后，Bax蛋白表達(dá)略為升高但均沒有顯著意義(P＞0.05)；而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高且有顯著性差異(P＜0.01)。Ad-Gax轉(zhuǎn)染PASMCs后，低氧刺激可使Bax蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，且凋亡率與Bcl-2/Bax比值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了正常PASMCs在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都有Gax基因的表達(dá)；低氧可使PASMCs中Gax基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻

12、譯水平的表達(dá)均下調(diào)，并且隨著低氧時(shí)間的延長，下調(diào)程度越來越顯著，具有時(shí)間依賴性。說明低氧是下調(diào)PASMCs中Gax基因表達(dá)的一個(gè)因素。 2.Ad-Gax重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染PASMCs后，Gax基因能夠在PASMCs中進(jìn)行高效過表達(dá)。 3.低氧能夠誘導(dǎo)PASMCs增殖；Ad-Gax轉(zhuǎn)染使PASMCs中Gax基因過表達(dá)后，可抑制低氧引起的PASMCs增殖，其作用機(jī)制可能與Gax基因下調(diào)c-fos、c-junmRNA表達(dá)有關(guān)。