脊髓γ-氨基丁酸能和腦啡肽能神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)及發(fā)育模式的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸（GABA）和腦啡肽（ENK）能神經(jīng)元是脊髓背角重要的中間神經(jīng)元，這些神經(jīng)元與初級傳入纖維、背角淺層的投射神經(jīng)元、來自上位腦結(jié)構(gòu)的下行投射纖維以及其他類型的中間神經(jīng)元之間形成復(fù)雜的局部環(huán)路，在感覺信息傳遞和調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用。由于成熟中間神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)及功能形成于發(fā)育時(shí)期，它們的正常發(fā)育是上述局部環(huán)路正確形成的保證，因此很有必要從發(fā)育階段對其開展研究。但目前有關(guān)脊髓背角GABA能和ENK能中間神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)、產(chǎn)生

2、模式、遷移特點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制等尚存許多空白。
　　本研究利用特異性顯示GABA能神經(jīng)元的谷氨酸脫羧酶（GAD）67-綠色熒光蛋白（GFP）基因敲入小鼠和特異性顯示ENK能神經(jīng)元的前原腦啡肽（PPE）-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，綜合運(yùn)用神經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)等手段，開展了以下三部分研究內(nèi)容：
　　1.脊髓背角GABA能和ENK能神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)
　　運(yùn)用熒光原位雜交與免疫熒光雙標(biāo)、單細(xì)胞RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)，對

3、GAD67-GFP基因敲入小鼠和PPE-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，并系統(tǒng)觀察了脊髓背角GABA能和ENK能神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)、相互的共存關(guān)系及5-HT3A受體的表達(dá)。結(jié)果如下：
　?。?）免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示GAD67-GFP基因敲入小鼠脊髓GFP陽性細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元核蛋白(NeuN)，背角淺層GFP細(xì)胞分別占I、Ⅱ和Ⅲ層NeuN陽性胞核的31.51％、33.34％和44.70％。將近98％的GFP細(xì)胞表達(dá)

4、GAD67和GABA。原位雜交組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)雙標(biāo)結(jié)果顯示所有GFP陽性細(xì)胞與GAD67mRNA共存。PPE-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠不同腦區(qū)GFP與PPEmRNA的表達(dá)模式一致。脊髓GFP陽性細(xì)胞均與NeuN、PPEmRNA共存。脊髓背角GFP陽性細(xì)胞分別占I、Ⅱ和Ⅲ層NeuN陽性神經(jīng)元的16.95％、40.68％和12.45％。上述結(jié)果提示這兩種小鼠中GFP的表達(dá)可特異顯示脊髓GABA能和ENK能神經(jīng)元。
　?。?）脊髓背角58

5、.38％、19.63％和2.81％的GABA能神經(jīng)元分別與鈣視網(wǎng)膜蛋白（CR）、小白蛋白（PV）和維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白（CB）共存；脊髓背角ENK能神經(jīng)元與CR、PV和CB的共存率為61.15％、5.05％和24.74％；12.44％的ENK能神經(jīng)元與一氧化氮合酶（NOS）共存；脊髓背角ENK能神經(jīng)元與囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（VGLUT1）和VGLUT2的共存比例為20.61％和21.21％；脊髓背角GABA能神經(jīng)元與PPEmRNA的

6、共存細(xì)胞占GABA能神經(jīng)元的44.41％，占PPEmRNA的53.93％；單細(xì)胞PCR結(jié)果表明脊髓背角28.07％的GABA能神經(jīng)元和22.58％的ENK能神經(jīng)元表達(dá)5-HT3A受體。上述結(jié)果為更好的理解GABA能和ENK能神經(jīng)元在脊髓的功能提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　2.脊髓GABA能神經(jīng)元的發(fā)育模式及調(diào)控機(jī)制
　　運(yùn)用GAD67-GFP基因敲入小鼠和Ebf2基因敲除小鼠，結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)、BrdU標(biāo)記、脊髓片培養(yǎng)、Time-

7、lapse熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察及單細(xì)胞RT-PCR等技術(shù)，觀察了脊髓GABA能神經(jīng)元的時(shí)空分布、起源、遷移模式和調(diào)控機(jī)制。結(jié)果如下：
　?。?）GABA能神經(jīng)元最早出現(xiàn)在胚胎11.5天（E11.5）脊髓的腹側(cè)部，至胚胎晚期和生后階段，主要分布在脊髓背角，于E17達(dá)到高峰。至P14，GABA能神經(jīng)元的分布達(dá)到與成年脊髓相似的模式。上述結(jié)果提示脊髓GABA能神經(jīng)元的分布具有明顯的時(shí)間和空間分布特點(diǎn)，呈由腹側(cè)向背側(cè)的分化趨勢。
　　

8、（2）脊髓GABA能神經(jīng)元的產(chǎn)生主要集中在E10.5-E14.5。E11.5和E13.5是兩個(gè)產(chǎn)生高峰，E10.5產(chǎn)生的GABA能神經(jīng)元較少，且主要位于脊髓前角。E11.5和E13.5產(chǎn)生的GABA神經(jīng)元主要分布在脊髓背角淺層和中央管周圍。脊髓背角深層的GABA能神經(jīng)元多產(chǎn)生于E12.5。胚胎晚期僅產(chǎn)生較少的GABA能神經(jīng)元。
　　（3）在體和離體結(jié)果均表明胚胎晚期脊髓套層部分GABA能神經(jīng)元表達(dá)細(xì)胞周期標(biāo)記物Ki-67、5-溴-

9、2′-脫氧尿苷（BrdU）和磷酸化的組蛋白H-3（P-H3），提示這些GABA能神經(jīng)元具有增殖活性。推測在套層內(nèi)這些具有增殖活性的GABA能神經(jīng)元是胚胎晚期脊髓GABA能神經(jīng)元的一個(gè)新的來源。
　?。?）脊髓GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生后以放射狀遷移的方式到達(dá)脊髓套層，然后向背腹方向移動(dòng)到達(dá)其終止部位。E10.5產(chǎn)生的GABA能神經(jīng)元主要遷移至脊髓前角，而E11.5產(chǎn)生的GABA能神經(jīng)元?jiǎng)t主要遷移至脊髓背角。不同階段產(chǎn)生的神經(jīng)元具有特定的

10、遷移模式。
　　（5）Ebf2基因敲除小鼠脊髓背角Pax2的表達(dá)下調(diào)，Lmx1b、Drg11和Tlx3的表達(dá)未發(fā)生改變。上述結(jié)果提示Ebf2參與了脊髓GABA能神經(jīng)元的發(fā)育調(diào)控。
　　3.脊髓ENK能神經(jīng)元的發(fā)育模式
　　運(yùn)用PPE-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，觀察了脊髓ENK能神經(jīng)元的時(shí)空分布、發(fā)育階段ENK能神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)及其表達(dá)的調(diào)控分子。結(jié)果如下：
　?。?）ENK能神經(jīng)元最早出現(xiàn)在E1

11、1.5頸段脊髓腹內(nèi)側(cè)部，腰段脊髓ENK能神經(jīng)元在E12.5出現(xiàn)。在E13.5，ENK能神經(jīng)元主要分布在中間帶。E14.5時(shí)脊髓背側(cè)開始出現(xiàn)ENK能神經(jīng)元，之后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，于胚胎晚期和生后階段，ENK能神經(jīng)元主要分布在脊髓背角，P21達(dá)到與成年類似的分布模式。上述結(jié)果提示脊髓ENK能神經(jīng)元的分布具有明顯的時(shí)間和空間分布特點(diǎn)，呈腹側(cè)向背側(cè)、吻側(cè)向尾側(cè)的發(fā)育趨勢。
　　（2）發(fā)育階段脊髓背角ENK能神經(jīng)元與GABA能神經(jīng)元的共存比

12、率較恒定，E16時(shí)共存細(xì)胞占ENK能神經(jīng)元的43.35％，P3時(shí)雙標(biāo)細(xì)胞占ENK能神經(jīng)元的45.02％。不同發(fā)育階段ENK能神經(jīng)元與CB、PV及CR的共存率不同，提示在ENK能神經(jīng)元的發(fā)育成熟的不同時(shí)程中發(fā)揮不同的功能。
　?。?）E15.5時(shí)ENK能神經(jīng)元與Pax2的共存細(xì)胞占ENK能神經(jīng)元的65.17％；至P3，GFP/Pax2雙標(biāo)神經(jīng)元占ENK能神經(jīng)元的57.74％，且主要分布在背角淺層。在脊髓背角Ⅰ層觀察到ENK能神經(jīng)元與

13、Lmx1b的共存細(xì)胞，在E15和E18，共存細(xì)胞分別占脊髓背角ENK能神經(jīng)元的3.48％和4.50％。上述結(jié)果為深入探討脊髓ENK能神經(jīng)元的發(fā)育調(diào)控分子機(jī)制提供了形態(tài)依據(jù)。
　　通過上述研究得到了以下結(jié)論：（1）較系統(tǒng)地觀察了脊髓背角GABA能和ENK能神經(jīng)元所包含的神經(jīng)活性物質(zhì)和5-HT受體亞型，為闡明這兩類神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；（2）揭示了脊髓GABA能和ENK能神經(jīng)元的時(shí)間和空間分布特點(diǎn)及GABA能神經(jīng)元的遷移

14、模式；（3）明確了脊髓GABA能神經(jīng)元的產(chǎn)生時(shí)程規(guī)律；首次發(fā)現(xiàn)了胚胎發(fā)育晚期脊髓套層內(nèi)存在GABA能神經(jīng)元祖細(xì)胞，提出了脊髓GABA能神經(jīng)元的新起源；（4）證實(shí)Ebf2基因參與脊髓GABA能神經(jīng)元的發(fā)育調(diào)節(jié)。
　　GABA能和ENK能神經(jīng)元作為脊髓背角局部環(huán)路重要的組成部分，對感覺傳遞的調(diào)控發(fā)揮重要作用。因此探討脊髓背角GABA能和ENK能中間神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)、神經(jīng)元的產(chǎn)生、分化特點(diǎn)、遷移方式及調(diào)控基因等，不僅有助于理解正常生