川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療對(duì)nO-STZ大鼠腎功能的影響機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過(guò)選用出生當(dāng)日的Wistar大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)n0-STZ大鼠模型;對(duì)比二甲雙胍和川芎嗪(TMP)與氨基胍(AG)聯(lián)合治療的療效，探討TMP+AG對(duì)n0-STZ大鼠腎功能的影響及其機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.動(dòng)物模型的制備與分組:出生當(dāng)日的Wistar大鼠，一次性腹腔注射STZ(90mg/kg)誘導(dǎo)n0-STZ大鼠模型。普通飼料喂養(yǎng)至8周齡，空腹血糖≥7.0mmol/L者選入本研究組。設(shè)立

2、正常對(duì)照組（NC組）、胰島素抵抗對(duì)照組（IR組）、二甲雙胍（MET組）及川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療組(TMP+AG組)。
　　 2.血液生化檢測(cè):分別于8周齡和32周齡斷尾取空腹血，檢測(cè)空腹血糖(FPG)，空腹胰島素(FINS)和糖化血清白蛋白(GSP)。根據(jù)公式胰島素抵抗指數(shù)(IRI)=(FPG·FINS)/22.5求值。
　　 3.腎功能指標(biāo)檢測(cè):32周齡，將大鼠置于金屬代謝籠中，收集24h尿液，雙縮脲法測(cè)尿蛋白，全自動(dòng)

3、生化分析儀測(cè)尿肌酐。以內(nèi)生肌酐清除率反映腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR):GFR=（尿肌酐×尿量）÷血肌酐。32周齡，摘右側(cè)眼球取血，離心留取血清，酶學(xué)法檢測(cè)血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。
　　 4.腎組織勻漿中NO濃度，iNOS、TNOS活性檢測(cè):10％腎組織勻漿，依次加入試劑，充分混勻，37℃孵育30分鐘，490nm(NO)或530nm(iNOS和TNOS)波長(zhǎng)測(cè)各管的吸光值。
　　 5.腎臟形態(tài)學(xué)觀察:腎組織切片行蘇木

4、素—伊紅(HE)染色，觀察形態(tài)學(xué)變化。
　　 6.免疫組化:常規(guī)脫蠟水化，Ⅰ抗4℃過(guò)夜（iNOS1∶50;3-NT1∶100），PBS陰性對(duì)照。
　　 7.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):測(cè)定目的基因iNOSmRNA和β-actinmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值，計(jì)算其比值。
　　 8.Western-blot檢測(cè)iNOS和3-NT:10％凝膠、上樣、電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、一抗孵育(iNOS1∶200，3-NT1∶5

5、00，4℃過(guò)夜)、二抗1∶5000，37℃孵育1h，暗室曝光顯影。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠生存率:IR組、MET組和TMP+AG組生存率均明顯低于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組生存率均明顯高于IR組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組間生存率差異不顯著(P＞0.05)。
　　 2.血液生化檢測(cè):8周齡，IR組的FPG、FINS、IRI和GSP均高于NC組(P＜0.05)。32周齡

6、，MET組和TMP+AG組均能降低FPG、FINS、IRI、GSP(P＜0.05)，但聯(lián)合治療更能提高胰島素敏感性、降低GSP含量(P＜0.05)。
　　 3.腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果:和NC相比，IR組血尿素氮、血肌酐、尿蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，GFR明顯下降(P＜0.05)。MET組和TMP+AG組均能改善n0-STZ大鼠的腎功能，但TMP+AG組血尿素氮，血肌酐降低更甚，腎小球的濾過(guò)率顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。

7、　　 4.腎組織勻漿中NO濃度，iNOS、TNOS活性變化:IR組的NO濃度，iNOS、TNOS活性相較于NC組明顯增加(P＜0.05)，TMP+AG組在降低NO濃度，iNOS、TNOS活性方面稍強(qiáng)于MET組(P＜0.05)。
　　 5.腎臟形態(tài)學(xué)觀察:HE染色結(jié)果顯示，NC組腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)完整，組織形態(tài)學(xué)正常，IR組腎小管萎縮、退化、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)含量增加，治療組的形態(tài)相較于IR組有

8、明顯改變，聯(lián)合治療組的組織學(xué)形態(tài)向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
　　 6.免疫組化結(jié)果:
　　 iNOS:NC組可見(jiàn)極少iNOS表達(dá)，而IR組腎小管中表達(dá)顯著高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組均少于IR組(P＜0.05)，但TMP+AG組減少更多(P＜0.05)。四組的腎小球均未見(jiàn)表達(dá)。
　　 3-NT:NC組中腎小管可見(jiàn)少量棕褐色顆粒表達(dá)，IR組顆粒表達(dá)顯著增加、增粗(P＜0.05)，MET組的顆粒相較于I

9、R組減少明顯(P＜0.05)，TMP+AG組的免疫染色更弱(P＜0.05)。
　　 7.RT-PCR半定量檢測(cè)iNOSmRNA結(jié)果:TMP+AG組可以降低iNOSmRNA的表達(dá)(P＜0.05)，兩治療組間的差異不明顯(P＞0.05)。
　　 8.Westernblot檢測(cè)結(jié)果:MET組和TMP+AG組均能抑制腎組織中iNOS和3-NT的表達(dá)(P＜0.05)，TMP+AG組效果更顯著(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:

10、
　　 1.一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)的n0-STZ大鼠模型的FPG、FINS、IRI和GSP指標(biāo)都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高，大鼠存活期縮短，腎功能受損明顯;腎組織中NO濃度，iNOS、TNOS活性，3-NT含量均升高，提示其腎功能的受損可能與NO、iNOS、TNOS、3-NT表達(dá)升高密切相關(guān)。
　　 2.川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療可減少n0-STZ大鼠腎組織NO表達(dá)，抑制iNOS、TNOS活性，降低3-NT表達(dá)，顯著改善大鼠腎