川芎嗪聯(lián)合順鉑對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：小細(xì)胞肺癌約占肺癌的20％，其惡性程度高、發(fā)展迅速、早期可有遠(yuǎn)處廣泛的轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。雖然小細(xì)胞肺癌對化療敏感，近期療效好，但遠(yuǎn)期容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和耐藥。盡管新一代化療藥物不斷面世，抗癌作用進一步增強，但其毒副作用仍不可避免。并且未能完全解決化療藥物的抗藥問題，從而限制其臨床應(yīng)用，致使部分患者的存活率未能提高。
　　 川芎嗪具有抑制某些實體腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的作用，其機制與促進機體免疫功能及誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)。順鉑為當(dāng)前治療小細(xì)胞肺

2、癌最常用的藥物之一，具有抗癌譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用、且無交叉耐藥等特點。近年來的一些研究表明，某些化療藥物與川芎嗪聯(lián)合應(yīng)用，可以提高腫瘤的治療效果。本試驗通過應(yīng)用川芎嗪與順鉑對接種人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446裸鼠進行藥物作用后，通過測量裸鼠腫瘤體積及腫瘤重量的變化，觀察以上藥物治療對瘤體生長情況的影響。同時通過應(yīng)用川芎嗪與順鉑對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446進行一定的藥物影響，觀察以上藥物作用后對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

3、的增殖、凋亡的影響情況。
　　 材料與方法：動物實驗分為四組：對照組，川芎嗪治療組，順鉑治療組，川芎嗪聯(lián)合順鉑治療組。各組裸鼠右臀部皮下分別一次性注射約1×107個NCI-H446細(xì)胞，液體總量為0.2ml。對照組接種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后常規(guī)飼養(yǎng)動物。各用藥組接種后一周開始給藥。川芎嗪治療組給予川芎嗪注射液100 mg/kg腹腔內(nèi)注射，每天1次，連續(xù)21天。順鉑治療組給予順鉑注射液2mg/ kg腹腔內(nèi)注射，每3天注射一次，連續(xù)7次。

4、聯(lián)合治療組依前述方法將川芎嗪組和順鉑聯(lián)合應(yīng)用。各組裸鼠在治療結(jié)束后5天脫頸法處死，75％酒精中浸泡2～3分鐘。取出瘤體，將瘤體移入培養(yǎng)皿中，清除外周血塊及結(jié)締組織，用含4萬IU/ml青霉素+4萬IU/ml鏈霉素的生理鹽水沖洗。用精密天平測量瘤體的重量，并用游標(biāo)卡尺測量瘤體的長與寬，計算體積。切取各組新鮮瘤塊組織，置于4％多聚甲醛固定液中固定72小時后，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察，拍照。切取各組新鮮瘤塊組織1mm3大小數(shù)塊，迅

5、速放入4℃預(yù)冷的戊二醛和多聚甲醛混合固定液中固定，1％鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察瘤組織超微結(jié)構(gòu)。
　　 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446，在含10％胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液中37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液一次，并以0.25％的胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞學(xué)實驗分成四組：空白組、川芎嗪治療組、順鉑治療組及川芎嗪聯(lián)合順鉑治療組，分別通過MTT試驗、集落形成試驗、流式細(xì)胞儀檢測、R

6、T-PCR和Western blot檢測各組NCI-H446細(xì)胞增殖、凋亡以及增殖相關(guān)基因cyclin D1、P16和凋亡相關(guān)基因Bcl-2、p53的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.治療方案結(jié)束時，通過精神狀態(tài)、活動狀況、對刺激的反應(yīng)、體重下降幅度、食欲5項指標(biāo)的觀察，評價裸鼠生存質(zhì)量和對藥物的毒副反應(yīng)。結(jié)果顯示：川芎嗪治療組裸鼠無明顯的藥物毒副反應(yīng)，生存質(zhì)量好；對照組裸鼠也無明顯的藥物毒副反應(yīng)，生存質(zhì)量一般；順鉑治療組

7、和川芎嗪聯(lián)合順鉑治療組藥物毒副反應(yīng)均較重，聯(lián)合治療組的毒副反應(yīng)比順鉑治療組的毒副反應(yīng)輕，表明川芎嗪聯(lián)合順鉑治療可降低單獨應(yīng)用順鉑治療的毒副反應(yīng)。
　　 2.治療后觀察裸鼠腫瘤的體積：川芎嗪治療組（14.36±2.54）、順鉑治療組（12.12±1.57）以及聯(lián)合治療組（8.22±3.05）腫瘤的體積小于對照組（15.13±6.38），差異有顯著性。裸鼠腫瘤的重量：川芎嗪治療組（0.0948±0.0328）、順鉑治療組（0.049

8、6±0.0299）以及聯(lián)合治療組（0.0264±0.0257）腫瘤的重量低于對照組（0.1255±0.0412），差異有顯著性。聯(lián)合治療組裸鼠腫瘤體積減小、重量降低的更加明顯，差異有顯著性。
　　 3.裸鼠瘤塊光鏡、電鏡觀察檢測瘤體符合小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特點。光鏡結(jié)果顯示川芎嗪治療組瘤組織變性壞死，瘤細(xì)胞內(nèi)可見較多脂滴。順鉑治療組瘤細(xì)胞排列疏松，部分細(xì)胞體積變小。聯(lián)合治療組瘤細(xì)胞稀少，體積變小，核固縮，瘤細(xì)胞間有結(jié)締組織增生，纖維化

9、明顯，可見較多成纖維細(xì)胞。透射電鏡檢查結(jié)果顯示川芎嗪治療組瘤細(xì)胞脂肪變性多見，細(xì)胞漿內(nèi)脂滴增多，可見較多壞死細(xì)胞及其碎片，細(xì)胞胞膜不完整，細(xì)胞器減少，并且結(jié)構(gòu)不清，呈空泡狀。順鉑治療組瘤細(xì)胞分布稀少，且體積明顯變小，并可見較多細(xì)胞碎片，部分細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多，腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象常見。聯(lián)合治療組瘤細(xì)胞分布稀少，瘤細(xì)胞體積小，組織內(nèi)細(xì)胞碎片多，細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)增多，腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象更加常見，可見較

10、多凋亡小體形成。
　　 4.經(jīng)川芎嗪、順鉑及聯(lián)合治療后NCI-H446細(xì)胞存活的細(xì)胞減少，細(xì)胞變圓，壞死。MTT實驗顯示在72小時及96小時的吸光度值川芎嗪治療組（1.031±0.034）（1.129±0.049），順鉑治療組（0.986±0.028）（1.018±0.038）以及聯(lián)合治療組（0.854±0.036）（0.923±0.041）與空白組相比（1.336±0.067）（1.437±0.045），明顯降低。提示用藥后各

11、組的細(xì)胞增殖性降低，且聯(lián)合治療組降低的程度最大，差異有顯著性。集落形成實驗顯示NCI-H446細(xì)胞集落形成率川芎嗪治療組（17.9±3.7），順鉑治療組（15.8±3.5）以及聯(lián)合治療組（11.2±2.9）與空白組相比（23.8±4.2），明顯減少。結(jié)果同樣顯示用藥后各組的NCI-H446細(xì)胞增殖性下降，且聯(lián)合治療組下降的程度最大，差異有顯著性。RT-PCR及Western blot實驗結(jié)果顯示川芎嗪、順鉑以及聯(lián)合用藥后，NCI-H44

12、6細(xì)胞的增殖性下降的同時P16基因的表達水平升高，cyclin D1的表達水平下降，差異有顯著性。
　　 5.經(jīng)吖啶橙（AO）和嗅乙啶（EB）染色檢測細(xì)胞凋亡顯示川芎嗪治療組（11.36±2.18）、順鉑治療組（15.73±3.25）及聯(lián)合治療組（21.32±3.27）與空白組比較（5.21±1.94）細(xì)胞凋亡率增加，差異有顯著性，且聯(lián)合治療組凋亡率增加最明顯，差異有顯著性。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示川芎嗪治療組（16.37±1

13、.23）、順鉑治療組（19.2±1.51）及聯(lián)合治療組（21.2±1.79）與空白組比較（5.23±1.01）細(xì)胞凋亡率增加，差異有顯著性，且聯(lián)合治療組凋亡率增加最明顯，差異有顯著性。DNA電泳顯示，除對照組外，其余各組NCI-H446細(xì)胞均可引起DNA斷裂，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用與單獨應(yīng)用相比DNA損傷程度增加。RT-PCR及western blot實驗結(jié)果顯示川芎嗪、順鉑及聯(lián)合治療作用后各組NCI-H446細(xì)胞Bcl-2基因的表達水平降低

14、，p53基因的表達水平升高。
　　 結(jié)論：
　　 1.川芎嗪、順鉑及聯(lián)合治療均可抑制成瘤裸鼠的腫瘤生長。二者聯(lián)合作用對成瘤裸鼠的腫瘤生長抑制作用強于單獨應(yīng)用順鉑。
　　 2.川芎嗪單獨應(yīng)用可一定程度提高裸鼠的生活質(zhì)量，川芎嗪聯(lián)合順鉑治療可以降低順鉑的毒副反應(yīng)。
　　 3.川芎嗪、順鉑以及二者聯(lián)合應(yīng)用均可誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌成瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 4.川芎嗪、順鉑及聯(lián)合治療均可降低小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株N

15、CI-H446的增殖能力。二者聯(lián)合作用對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446的增殖抑制作用強于單獨應(yīng)用順鉑。各組小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446增殖能力降低的同時細(xì)胞cyclin D1的表達水平降低，P16的表達水平升高。
　　 5.川芎嗪、順鉑及二者聯(lián)合應(yīng)用均可誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合作用對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446細(xì)胞凋亡作用強于單獨應(yīng)用順鉑。誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞凋亡同時其Bcl-2表達水