川芎嗪與氨基胍延長(zhǎng)胰島素抵抗大鼠存活期的機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)當(dāng)日出生的Wistar大鼠建立胰島素抵抗(IR)模型，觀察該模型32周齡時(shí)的生存率。應(yīng)用川芎嗪(TMP)與氨基胍(AG)治療，探討TMP+AG對(duì)該模型存活期的影響及其機(jī)理。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：出生當(dāng)日Wistar大鼠，腹腔注射STZ(90mg/kg)復(fù)制IR模型。正常伺養(yǎng)至8周齡，空腹血糖≥7.0mmol/L或糖耐量試驗(yàn)餐后2小時(shí)血糖≥11.1mmol/L者選入本研究。設(shè)立正常

2、對(duì)照組(CN組)、胰島素抵抗對(duì)照組(IR組)、二甲雙胍(MET組)及川芎嗪+氨基胍(TMP+AG組)治療組。 2.空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)和糖化血清蛋白(GSP)檢測(cè)：分別于造模第8周、24周和32周斷尾取空腹血，檢測(cè)FPG，留取血清檢測(cè)FINS和GSP，根據(jù)公式(FPG·FINS)/22.5計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)。采用果糖胺法檢測(cè)各組GSP含量。 3.生化指標(biāo)檢測(cè)：于實(shí)驗(yàn)32周，摘眼球取血，離心

3、留取血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。 4.外周血白細(xì)胞原位雜交：于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取肝素抗凝血約1mL，檢測(cè)外周血白細(xì)胞klotho和IGF-1R mRNA，比較各組之間差異。 5.病理學(xué)檢測(cè)：腎組織學(xué)切片分別行蘇木素-伊紅(HE)染色、糖原(PAS)染色，觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。 6.免疫組織化學(xué)染色：觀察腎組織klotho蛋白、磷酸化的胰島素生長(zhǎng)因子

4、1受體(IGF-1R)蛋白表達(dá)。 7.實(shí)時(shí)定量RT-PCR：分別檢測(cè)腎組織晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、IGF-1R和klotho mRNA，腦組織IGF-1R和klotho mRNA，肝組織IGF-1R mRNA和外周血淋巴細(xì)胞的IGF-1R和klotho mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存率：IR組為35％(7/20)，MET組為70％(14/20)，TMP+AG組為85％(17/20)

5、，CN組為100％(20/20)。IR組、MET組和TMP+AG組生存率均明顯低于CN組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組生存率均明顯高于IR組(P＜ 0.05)，MET組和TMP+AG組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.FPG、FINS和GSP檢測(cè)結(jié)果：8周齡時(shí)，模型組的FPG、FINS、IRI和GSP含量均高于CN組(P＜0.05)。用藥8周(16周齡)時(shí)，MET組和TMP+AG組FPG、FINS、IRI和GSP均低于IR組

6、(P＜0.05)，高于CN組(P＜0.05)；TMP+AG組GSP含量低于MET組(P＜0.05)。用藥24周(32周齡)，MET組和TMP+AG組FPG和FINS較IR組進(jìn)一步降低(P＜0.05)；MET組和TMP+AG組FPG與CN組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)INS和IRI仍高于CN組；TMP+AG組與CN組間GSP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MET組GSP低于IR組，但仍高于CN組(P＜0.05)。 3.生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：各組血清TG、T

7、C和Cr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MET組和TMP+AG組的BUN較IR組明顯下降(P＜0.05)。 4.外周血白細(xì)胞原位雜交結(jié)果：IR組IGF-1R mRNA陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于CN組(P＜0.05)，TMP+AG組明顯低于IR組(P＜0.05)，而MET組高于IR組(P＜0.05)；IR組Klotho mRNA陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于CN組(P＜0.05)，TMP+AG組、MET組均高于IR組(P＜0.05)，TMP+AG組又高于MET組(

8、P＜0.05)。 5.病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，IR組兩例局部輕度系膜細(xì)胞增生，其余未見異常。PAS染色結(jié)果顯示，IR組兩例可見少量腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)糖原沉積，其余未見異常。 6.免疫組化結(jié)果：IR組腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合小管IGF-1R蛋白表達(dá)較CN組減少(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組較IR組明顯升高(P＜0.05)，TMP+AG組與CN組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MET組高于CN組(P＜0.05)。I

9、R組腎組織Klotho蛋白含量較CN組明顯下降(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組明顯高于IR組(P＜0.05)，MET組與TMP+AG組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7.實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果： (1)腎組織RAGE mRNA表達(dá)IR組顯著高于CN組(P＜0.05)。TMP+AG組明顯低于IR組(P＜0.05)，與CN組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MET組低于IR組(P＜0.05)，高于CN組(P＜0.05)。 (2)I

10、GF-1R mRNA表達(dá)： IR組腦、肝、外周血淋巴細(xì)胞較CN組明顯降低(P＜0.05)。TMP+AG組腦、肝組織較IR組明顯升高(P＜0.05)，外周血淋巴細(xì)胞較IR組降低(P＜0.05)；CN組、IR組和TMP+AG組間腎組織表達(dá)均無明顯差異。MET組腎、腦和外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)均較IR組明顯升高(P＜0.05)，肝組織的表達(dá)較IR組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)Klotho mRNA表達(dá)： IR組腎、腦、外周血淋

11、巴細(xì)胞較CN組明顯降低(P＜0.05)。TMP+AG組腎、腦組織較IR組明顯升高(P＜0.05)，與CN組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TMP+AG組外周血淋巴細(xì)胞與IR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MET組腎、腦、外周血淋巴細(xì)胞較IR組明顯升高(P＜0.05)，其中MET組腎組織的表達(dá)高于TMP+AG組(P＜0.05)，而在腦組織則低于TMP+AG組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.STZ可以誘導(dǎo)出生當(dāng)日Wistar大鼠產(chǎn)生IR。該模型FPG

12、、FINS、IRI和GSP都隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，其存活期明顯縮短。該模型多種組織中Klotho mRNA均表達(dá)下降，提示其高死亡率與Klotho基因表達(dá)降低密切相關(guān)。 2.TMP+AG可提高IR大鼠多種器官組織Klotho mRNA表達(dá)，抑制IR大鼠腎組織RAGE mRNA表達(dá)，并明顯降低大鼠死亡率。提示TMP+AG延長(zhǎng)IR大鼠存活時(shí)間的作用主要與調(diào)控Klotho及RAGE基因表達(dá)有關(guān)。其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。 3.該實(shí)