組織靶向肝素-SOD及季銨化殼聚糖-SOD結合物的制備及其對ROS誘導損傷的作用與機制研究.pdf

1、活性氧族（reactive oxygen species，ROS），例如超氧陰離子自由基（（））和H2O2等都能造成機體氧化性應激反應，成為許多疾病比如肝損傷、肺損傷的誘導因子。超氧化物歧化酶（SOD）能夠分解（），從而可防御由于氧化應激反應造成的損傷。然而體內試驗卻表明，SOD在抗炎、抗纖維化中發(fā)揮的作用不夠理想，需要的劑量較大。造成SOD在動物實驗和臨床試驗療效不理想的原因是由于SOD不理想的藥代動力學特點，即體內半衰期短（t1/2

2、大約6min）。為了改善SOD的藥代動力學性質，提高SOD的作用效果，本文設計研究了具有長效和組織或者細胞靶向性SOD，即用陰離子多糖肝素修飾的SOD（Hep-SOD）和用陽離子多糖N，N，N-三甲基季銨化殼聚糖（TMC）修飾的SOD（TMC-SOD），及它們的理化與生物學性質和對ROS引起的損傷的作用與機制。 本論文的主要研究內容與結果如下。 1 Hep-SOD與TMC-SOD的制備 采用高碘酸鈉氧化法活化肝素

3、，用活化的肝素在pH9.5、0.3 mol/L碳酸鹽溶液中對SOD進行化學修飾，反應產物通過電泳鑒定。對該修飾反應液進行預處理后，用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析進行修飾酶的分級分離，制備Hep-SOD結合物。 EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺）縮合法制備TMC-SOD。為增加殼聚糖的水溶性和陽電荷性質，先將殼聚糖用H2O2法降解，再通過N-位三甲基化，得到TMC。TMC在縮合

4、劑EDC的存在下對SOD進行修飾，得到TMC-SOD，修飾反應液進行預處理后，用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析進行修飾酶的分級分離得到TMC-SOD結合物。 SOD活性測定結果表明，天然SOD、TMC-SOD以及Hep-SOD酶活分別為3250、2830和2770 U/mg。采用MTT法測定證實，SOD的兩種結合物均無細胞毒性。 2 Hep-SOD、TMC-SOD的二級結構分析

5、采用圓二色譜法（CD）對SOD及其修飾物的二級結構進行研究，并比較其差別。結果顯示，在溶液狀態(tài)SOD與其兩種結合物的CD圖譜略有差異。具體來講，Hep-SOD比未修飾的SOD分子結構中α-helix比例增加（24.50％vs23.50％），而β-sheet的含量降低（48.3％ vs49.8％），同時，Random. Coil成分比例均略有下降（30.80％ vs31.90％）。研究表明，SOD經過TCM修飾以后在二級結構上也發(fā)生了一定

6、的變化，主要表現(xiàn)在α-helix降低（20.70％ vs23.50％）；β-構象的含量升高（53.7％ vs49.8％），同時，Random. Coil的含量升高（37.90％ vs31.90％）。但總體而言，SOD經過修飾前后對二級結構的影響都不大，這與修飾前后對SOD酶活的影響不大一致。 3 SOD結合物對巨噬細胞的靶向性研究 3.1 SOD結合物對細胞內SOD酶活、總抗氧能力（T-AOC）、超氧陰離子釋放的影響

7、 本研究考察了SOD結合物對淀粉誘導的小鼠腹腔巨噬細胞內SOD酶活力和T-AOC以及對抑制（）釋放的影響。結果顯示，正常小鼠腹腔巨噬細胞內SOD酶活性為48.34±5.39 U/mg蛋白，巨噬細胞與各用藥組共同孵育以后細胞內酶活性均升高，其中SOD組細胞內酶活升高到62.92±6.00 U/mg蛋白，與正常細胞內酶活相比差異不顯著（P>0.5），而Hep-SOD組和TMC-SOD組細胞內酶活性升高均非常顯著，分別達到162.2±7.

8、20和408.04±15.91 U/mg蛋白，與正常細胞內酶活相比具有顯著性差異（P<0.01）。結果還表明，正常小鼠腹腔巨噬細胞內T-AOC為9.50±1.49 U/mg蛋白，巨噬細胞與各用藥組共同孵育以后細胞T-AOC均升高，SOD組細胞內T-AOC升高到11.89±2.28 U/mg蛋白，與正常細胞內T-AOC相比差異不顯著（P>0.5），而Hep-SOD組和TMC-SOD組細胞內T-AOC升高非常顯著，分別達到32.39±2.9

9、4 U/mg蛋白和71.36±5.35 U/mg蛋白（P<0.01）。研究顯示，Hep-SOD和TMC-SOD均能夠抑制巨噬細胞（）的釋放，影響趨勢與各用藥組對細胞內SOD酶活性的影響變化趨勢基本一致，TMC-SOD用藥組的抑制作用顯著高于其他用藥組。 3.2流式細胞技術檢測SOD結合物對巨噬細胞的結合能力 本研究借助流式細胞儀檢測考察SOD及其兩種結合物對巨噬細胞的結合能力。FITC標記的SOD、Hep-SOD以及TM

10、C-SOD與小鼠腹腔巨噬細胞共同孵育，結果表明，TMC-SOD對細胞的結合能力最強，其次是Hep-SOD，陽性率分別為95.36％和29.2％，而SOD孵育組陽性率只有22％；當延長孵育時間達到2h，陽性率均升高，其中SOD、Hep-SOD組分別升高到37.64％和51.81％。 3.3激光共聚焦顯微鏡技術研究SOD及其修飾物巨噬細胞內分布 FITC標記的SOD及SOD衍生物與巨噬細胞共孵育1 h后，SOD組的熒光信號

11、較弱，而Hep-SOD組和TMC-SOD組的熒光信號與SOD組相比有不同程度的增強，其中，Hep-SOD組熒光略強于SOD組。FITC標記的SOD及SOD衍生物與巨噬細胞共孵育2h后，熒光強度均比1h時的相同藥物組有不同程度的增強，且兩個修飾物組均表現(xiàn)出比SOD組更強的熒光強度。 4 Hep-SOD結合物對CCl4誘導的急性肝損傷和肝纖維化的防治作用 4.1 Hep-SOD結合物對CCl4誘導的急性肝損傷的作用

12、本研究采用CCl4腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷，立即尾靜脈注射給藥。用藥24 h取血測定血清LDH、GSH和GOT/GPT活性；取肝組織測定MDA含量。結果顯示，Hep-SOD以及Hep+SOD組轉氨酶濃度均低于模型組，但高于正常對照組。結果還顯示腹腔注射CCl4不僅導致血液GOT/GPT、LDH以及肝組織MDA濃度升高，還同時降低GSH的濃度。研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射Hep-SOD能夠顯著降低LDH，同時增高GSH的濃度。各生化指標顯示，與

13、天然SOD相比，Hep-SOD保肝作用更為顯著，Hep-SOD對CCl4誘導的急性壞死性肝損傷具有很理想的預防和保護作用。肝素用藥組在本實驗中沒發(fā)現(xiàn)有明顯的療效。 4.2 Hep-SOD結合物對CCl4誘導的肝纖維化的防治作用 本研究采用CCl4腹腔注射，每周2次，連續(xù)12周誘導小鼠肝纖維化，在CCl4注射后立即腹腔注射給藥，最后一次用藥24 h后眼球取血處死動物，進行以下實驗。 （1）羥脯氨酸測定 （2）肝

14、臟病理學檢測 （3）Hep-SOD對小鼠肝組織相關mRNA轉錄水平的影響 （4）Hep-SOD對小鼠肝組織TGF-β1蛋白表達水平的影響 5 TMC-SOD結合物對CCl4誘導的急性肝損傷和肝纖維化的防治作用 5.1 TMC-SOD對急性肝損傷的保護作用 采用對CCl4注射的小鼠尾靜脈注射TMC-SOD。用藥后24 h取血處死，測定血液生化指標GOT/GPT、GSH、LDH以及肝組織中MDA含量。結果

15、顯示，CCl4誘導急性肝損傷通過降低GSH水平、提高脂質過氧化來改變組織氧化還原狀態(tài)。而上述變化在TMC-SOD用藥組以及TMC+SOD用藥組均得到部分抑制。各生化指標顯示，與其他用藥組相比，TMC-SOD組對急性肝損傷的改善作用最顯著。 5.2 TMC-SOD對肝纖維化的保護作用 本研究采用TMC-SOD和CCl4同時腹腔注射小鼠，每周兩次，連續(xù)12周。組織病理學以及羥脯氨酸含量測定均表明TMC-SOD能夠有效防治肝纖

16、維化。本研究還采用RT-PCR測定TGF-β1、MMP-2以及collagen-I等的mRNA。測定結果顯示，CCl4連續(xù)注射12周能夠使上述mRNA顯著升高，而TMC-SOD用藥組能夠有效降低上述mRNA水平。 本研究取得的主要結論: （1）成功制備分離得到了Hep-SOD和TMC-SOD兩種多糖結合物，并借助CD技術對兩種結合物二級結構進行了分析，發(fā)現(xiàn)該制備過程對SOD二級結構影響不大。 （2）聚陰離子黏多糖--

17、肝素以及聚陽離子黏多糖--TMC是較理想的巨噬細胞靶向性修飾劑，其中TMC的靶向性修飾效果更好。 （3）Hep-SOD通過升高GSH的濃度和降低TGF-β1的表達，能夠防治CCl4造成的急性肝損傷和肝纖維化，該防治作用可能是結合物的抗氧化作用和抗炎作用共同作用的結果。 （4）TMC-SOD結合物防治急性肝損傷和肝纖維化作用顯著。TMC-SOD將有望成為治療由于氧化應激作用導致的肝纖維化和急性肝損傷的有效藥物。 （5）與