胰島素-低分子季銨化殼聚糖復(fù)合物的制備、理化性質(zhì)及其生物活性研究.pdf

1、胰島素(Insulin，Ins)作為治療糖尿病的首選藥物，臨床應(yīng)用已有70多年的歷史。由于胰島素是多肽類藥物，易被胃腸道蛋白酶水解破壞，因而口服無效，所以，臨床多年來一直是通過注射給藥。但長期頻繁使用注射液也會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)，如過敏、組織纖維化等，這給患者帶來了極大的身體、心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研究非注射用胰島素及其制劑是當(dāng)今國內(nèi)外醫(yī)藥界共同關(guān)注的課題。 本課題選擇LTMC，利用靜電作用對(duì)胰島素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，制備非注射

2、用胰島素。該修飾條件溫和，工藝簡單，產(chǎn)率高，修飾后的胰島素生物活性不受影響。用LTMC作為胰島素修飾劑，可起到保護(hù)胰島素和促進(jìn)胰島素吸收的作用。另外，本文通過舌下和口服給藥研究證實(shí)其降血糖效果顯著。因此，經(jīng)修飾的胰島素適用于非注射給藥及其制劑的研究。 本課題研究內(nèi)容、方法及結(jié)果主要有以下幾個(gè)方面。 1LTMC的制備及理化性質(zhì) 在前期研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì)制備LTMC的部分工藝進(jìn)行了改進(jìn)，由CTS制備LTMC，并對(duì)其

3、理化性質(zhì)進(jìn)行測定。工藝改進(jìn)后制備的LTMC樣品，其黏均分子量約為7KDa，季銨化度為46.64％，分子量分布均一，而且純度較高，并通過紫外和紅外初步確定了LTMC的季銨基團(tuán)及其特征。 2Ins-LTMC制備工藝研究根據(jù)質(zhì)量比，利用結(jié)合沉淀法篩選制備Ins-LTMC的Ins及LTMC的用量和最佳pH等，并通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究溫度、時(shí)間和溶液體積對(duì)Ins-LTMC制備的影響。初步確定了生產(chǎn)工藝路線，即在pH6.5溶液中，LTMC的用

4、量為Ins的1～1.25倍，4℃條件下結(jié)合反應(yīng)8小時(shí)。 3Ins-LTMC理化性質(zhì) 本文采用物理和化學(xué)的方法研究Ins-LTMC理化性質(zhì)。Ins-LTMC為白色或類白色粉末，易溶于無機(jī)酸或堿性水溶液，Ins-LTMC中LTMC的含量約為53％，胰島素含量約為47％，等電點(diǎn)為6.29，分子量分布較均一，純度較高，并保持Ins較好結(jié)構(gòu)及其生物活性。胰島素經(jīng)修飾后理化性質(zhì)穩(wěn)定，除等電點(diǎn)改變外，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)基本無改變。

5、4Ins-LTMC生物效價(jià) 本試驗(yàn)參照中國藥典2000版中胰島素效價(jià)測定方法及生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線測定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。結(jié)果Ins-LTMC效價(jià)為12.386U/mg，可信限率為FL％=8.5454％，符合藥典規(guī)定(不大于25％)。本試驗(yàn)測定的Ins-LTMC效價(jià)與估計(jì)效價(jià)相當(dāng)，說明該修飾方法對(duì)胰島素的活性影響較小。5Ins-LTMC舌下給藥降血糖效果 本試驗(yàn)通過家兔舌下給藥，研究幾種不同Ins修飾

6、物的降糖效果，并計(jì)算Ins-LTMC的相對(duì)生物利用度。結(jié)果各樣品組的降糖效果雖然不同，但與空白對(duì)照組和胰島素組比較均有非常顯著性差異(P＜0.01)；其中Ins-LTMC(M=7KDa，QD％=46.6％)組的降糖效果與皮下注射胰島素組比較無顯著性差異(P＞0.05)，其最大降糖效應(yīng)出現(xiàn)在60分鐘左右，血糖值最大下降59.83％，相對(duì)生物利用度達(dá)到52.53％。因此，本試驗(yàn)證實(shí)Ins-LTMC經(jīng)舌下給藥具有較好的降糖效果，可用于非注射給

7、藥，更適合于患者餐后血糖的控制。 6Ins-LTMC口服降糖效果及LTMC對(duì)胰蛋白酶活性的影響 主要研究了小鼠口服Ins-LTMC的降糖效果，并與口服胰島素對(duì)照組比較，結(jié)果二者的降糖效果具有非常顯著性差異(P＜0.001)。給藥120分鐘后血糖值下降21.03％±6.57％，說明經(jīng)修飾后的胰島素在胃腸內(nèi)的穩(wěn)定性和吸收性能顯著增加。另外，通過體外胰蛋白酶效價(jià)的測定研究了不同濃度的LTMC對(duì)胰蛋白酶活性的影響，結(jié)果LTMC對(duì)

8、胰蛋白酶的活性沒有影響。因此推測，Ins經(jīng)LTMC修飾后有可能阻礙了胰蛋白酶與胰島素的接觸而起到一種保護(hù)作用。 本項(xiàng)研究內(nèi)容目前國內(nèi)外未見報(bào)道。本文采用LTMC對(duì)Ins的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾實(shí)屬首次，其修飾方法可行，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，經(jīng)兩種非注射給藥研究均顯示較理想的降血糖效果。研究首次采用高效層析技術(shù)對(duì)胰島素及其修飾物進(jìn)行測定，并建立了Ins-LTMC定性和定量方法。該項(xiàng)研究首先為非注射用胰島素及其制劑的研究提供了理論依據(jù)，生產(chǎn)工藝及檢測