C反應(yīng)蛋白介導(dǎo)脂質(zhì)紊亂參與動脈粥樣硬化早期形成的研究.pdf

1、第一章 CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá) 目的：通過CRP直接處理內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥相關(guān)蛋白及mRNA的改變，探討不同濃度的CRP對內(nèi)皮細(xì)胞是否具有直接的致炎作用。 方法：分別通過細(xì)胞ELISA法檢測空白對照組，1 mg/L CRP組、5 mg/L CRP組、CRP 20mg/L組對內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)ICAM-1、以及可誘導(dǎo)型-氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase iNOS)在人臍靜脈內(nèi)皮

2、細(xì)胞的表達(dá)；RT-PCR法檢測空白對照組，1mg/L、5mg/L、10mg/L及20mg/LCRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果：對于ICAM-1的誘導(dǎo)與對照組沒有顯著差異(P>0.05)，而CRP 20mg/L組較其它組對ICAM-1有顯著的增加(P<0.01)。空白對照組，1mg/LCRP組與5mg/L CRP組對于iNOS的誘導(dǎo)與對照組沒有顯著差異(P>0.05)，而CRP 20mg/L組較其它組對iN

3、OS有顯著的增加(P<0.01)。同樣，RT-PCR結(jié)果顯示只有20 mg/LCRP可以明顯提高ICAM-1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：雖然目前有研究認(rèn)為高水平CRP可以誘導(dǎo)炎癥相關(guān)蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，但是本研究通過細(xì)胞ELISA法及RT-PCR法檢測CRP對內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥相關(guān)蛋白及其mRNA表達(dá)后認(rèn)為，CRP在正常生理水平對內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥相關(guān)蛋白及mRNA表達(dá)影響不大，僅在較高濃度情況下才可能對內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥相關(guān)因子表達(dá)產(chǎn)

4、生影響，因此如何解釋CRP在0～10 mg/L的正常生理水平條件下參與動脈粥樣硬化形成的過程，以及是否有其他因素參與值得進(jìn)一步探討。 第二章 CRP致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路篩選 目的：本研究通過特異性和敏感性較高的低通量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因芯片，探討高濃度的CRP處理對內(nèi)皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。 方法：設(shè)CRP處理組以及對照組，分別給予20 mg/L CRP或磷酸鹽緩沖液(PBS)與培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

5、進(jìn)行處理24 h，然后提取RNA進(jìn)行基因芯片檢測，采用的基因芯片共包含18個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：促有絲分裂通路、Wnt通路、Hedgehog通路、TGF-p通路、Survival通路、p53通路、應(yīng)激通路、NF-rd3通路、NFAT通路、CREB通路、Jak-Stat通路、雌激素通路、雄激素通路、鈣與蛋白激酶C通路、磷脂酸C通路、胰島素通路、低密度脂蛋白通路、維甲酸通路。 結(jié)果：CRP處理組較對照組分別有13種基因表達(dá)增加、25種基因

6、表達(dá)降低。CRP處理組信號通路增加最顯著的是WISP家族的表達(dá)增強(qiáng)，尤其WISP2，達(dá)到37.63倍；誘導(dǎo)凋亡關(guān)鍵信號通路p53相關(guān)基因表達(dá)增加30.5倍，而抑制凋亡相關(guān)信號通路Bcl-x相關(guān)基因表達(dá)降低10.41倍。 結(jié)論：以往針對CRP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活主要集中NF-kB通路和MAPKs系統(tǒng)，本研究通過基因芯片對參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的18條主要通路進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRP對于傳統(tǒng)認(rèn)為可以激活例如ICAM、VCAM、iNOS

7、等炎癥相關(guān)的信號通路在本研究均沒有顯著改變或低水平改變，而對于WISP及凋亡相關(guān)信號通路有較明顯的改變。目前認(rèn)為WISP家族是一族與細(xì)胞增殖相關(guān)生長因子，在某些炎癥條件下例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎被激活，參與炎癥過程，尤其是WISP2在慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展中起相當(dāng)關(guān)鍵的作用，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRP有可能是WISP2激活的直接因素，從而可能進(jìn)一步調(diào)控內(nèi)皮系統(tǒng)炎癥的發(fā)生。本研究同時發(fā)現(xiàn)p53信號顯著增強(qiáng)，達(dá)到對照組30.50倍，而bcl-x和bcl-2相關(guān)基

8、因則分別下調(diào)10.4倍和2.01倍。其中p53是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的信號通路之一，參與調(diào)控超過60種基因表達(dá)，而后兩者則是抑制細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的信號通路。因此得出結(jié)論，高于正常生理水平的CRP可能確實(shí)參與內(nèi)皮系統(tǒng)的炎癥發(fā)生，其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及激活細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白信號通路的表達(dá)。 第三章 CRP介導(dǎo)E-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究 目的：通過分析CRP的特殊結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)合LDL研究，探討CRP在動

9、脈粥樣硬化形成中可能具有的中間介質(zhì)作用。 方法：本研究參考文獻(xiàn)改進(jìn)LDL提取方法，通過一次性密度梯度超速離心，分離LDL，并且通過復(fù)合酶處理以及銅離子氧化法分別生成E-LDL和ox-LDL，并直接對CRP及LDL進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育，利用熒光顯微鏡檢測CRP及LDL與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，實(shí)驗(yàn)分為8組：空白對照組、CRP組、N-LDL組、ox-LDL，組、E-LDL組、CRP+N-LDL組、CRP+ox-LDL組、CRP+

10、E-LDL組。 結(jié)果： 1)通過超速密度梯度離心一次性提取LDL和LPDS，改進(jìn)了過去提取LDL需要2次超速離心，每次需要離心24-48小時的方法； 2)FITC可以直接對CRP進(jìn)行標(biāo)記，不干擾CRP的受體和配體結(jié)合位點(diǎn)，對CRP的生理功能沒有明顯的影響； 3)N-LDL和E-LDL不能夠被內(nèi)皮細(xì)胞識別，ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞有微弱的結(jié)合能力； 4)在CRP共孵育條件下，天然LDL和ox-LDL

11、不能夠聯(lián)結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞，而E-LDL可以高親和力與CRP結(jié)合，從而形成CRP/E-LDL復(fù)合體與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。 結(jié)論： CRP是一種雙面五聚體結(jié)構(gòu)，每個單體的配體識別位點(diǎn)或受體結(jié)合位點(diǎn)分別位于五聚體兩個平面上，分別組成配體識別相和效應(yīng)器相，從而構(gòu)成特殊的二相性結(jié)構(gòu)。由于CRP的識別相可以結(jié)合被暴露出磷酸膽堿結(jié)構(gòu)的E-LDL，形成E-LDL/CRP復(fù)合體，而內(nèi)皮細(xì)胞表面能以高親和力識別CRP的配體相，從而CRP二相性結(jié)構(gòu)具有結(jié)合E-L

12、DL，被內(nèi)皮細(xì)胞捕獲，引起脂質(zhì)沉積和激活補(bǔ)體、觸發(fā)炎癥反應(yīng)的可能性，這樣可以解釋早期動脈粥樣硬化為何同時存在E-LDL、CRP、補(bǔ)體，而這三種物質(zhì)在同時、同地出現(xiàn)絕非一個巧合。由此得出結(jié)論，CRP是一種保守蛋白，在正常生理水平主要參與壞死、凋亡細(xì)胞的清除，但是在脂質(zhì)代謝紊亂的情況下，能夠介導(dǎo)異常脂質(zhì)尤其是E-LDL參與動脈粥樣硬化的形成。 總結(jié)： 1)CRP是一種保守蛋白，在正常生理水平下對內(nèi)皮細(xì)胞沒有明顯的誘導(dǎo)炎癥發(fā)生

13、的作用，僅在高濃度條件下有可能誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)； 2)高于生理水平的CRP對內(nèi)皮細(xì)胞的致炎作用主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及激活細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白信號通路的表達(dá)； 3)CRP是一種雙面五聚體蛋白，結(jié)構(gòu)具有特殊的二相性，能夠分別結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞和E-LDL。因此，正常生理水平的CRP不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷，但是在有脂質(zhì)代謝紊亂的條件下，能夠介導(dǎo)E-LDL參與內(nèi)皮損傷，補(bǔ)體激活，從而觸發(fā)動脈粥樣硬化早期形成的過程。