兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代移植治療角膜內(nèi)皮損傷的初步研究.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代移植治療角膜內(nèi)皮損傷的初步研究姓名：劉小偉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：趙家良;龐國(guó)祥20040501中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文．3 ．兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代移植治療角膜內(nèi)皮損傷的初步研究中文摘要目的：分離培養(yǎng)兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞( C o r n e a l e n d o t h e l i a lc e l l sC E C

2、s ) 和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( M e s e n c h y m a ls t e m c e l l s M S C s ) ，觀察它們體外生長(zhǎng)情況；通過兔C E C s移植證明利用明膠( G e l a t i n ) 膜載體進(jìn)行C E C s 移植治療角膜內(nèi)皮損傷的可行性和初步效果，同時(shí)初步研究自體M S C s 移植到兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞部位后其形態(tài)和功能的分化。方法：采用揭膜聯(lián)合胰蛋白酶消化法分離C E C s 『；光鏡和電鏡對(duì)細(xì)胞

3、進(jìn)行觀察；原代C E C s 用B r d u 標(biāo)記后接種在G e l a t i n 膜載體上；利用a 一氰基丙烯酸脘基酯作為組織黏合劑，將接種有C E C s 的載體與機(jī)械去除了內(nèi)皮細(xì)胞的自體兔角膜植片相粘合，原位縫合進(jìn)行兔眼C E C s 移植；采用骨髓穿刺密度梯度離心方法分離兔自體骨髓M S C s ；并利用P E 標(biāo)記的C D 4 5 和F I T C 標(biāo)記的C D 4 4 單克隆抗體對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓M S C s 進(jìn)行鑒定；

4、同樣的方法用M S C s 替代C E C s 進(jìn)行移植；對(duì)照眼移植沒有接種任何細(xì)胞的載體膜。術(shù)后在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察兔眼角膜移植片的透明情況、角膜厚度和眼壓，并利用共焦顯微鏡進(jìn)行移植細(xì)胞的形態(tài)觀察和精確計(jì)數(shù)。術(shù)后觀察1 2 周，處死動(dòng)物，角膜標(biāo)本分別進(jìn)行組織切片、抗B r d u 單克隆抗體免疫組化染色和電鏡觀察。結(jié)果：揭膜聯(lián)合胰蛋白酶消化法可以獲得高純度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)4 8小時(shí)后細(xì)胞大部分貼壁，貼壁率5 4 3 ％，7 -

5、1 0 天基本匯合；細(xì)胞呈多角型，排列緊密，有明顯的接觸抑制。而骨髓穿刺密度梯度離心法獲得的M S C s ，體外培養(yǎng)9 6 小時(shí)內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，貼壁率約2 55 ％；原代培養(yǎng)的前5 ～6 天為細(xì)胞的潛伏期，7 ～1 2 天為細(xì)胞的指數(shù)增生期，之后進(jìn)入平臺(tái)期，大多在1 4 - 1 7 天匯合；細(xì)胞呈單一的成纖維細(xì)胞外觀，長(zhǎng)梭形，排列呈漩渦狀；體外培養(yǎng)的M S C sC D 4 s 表達(dá)陰性，而C D 4 4 表達(dá)陽(yáng)性，純度可達(dá)到9 4 ％左