趨化性細胞因子CCL3L1與HIV-1易感性和融合蛋白表達的研究.pdf

1、目的 (1)分析趨化性細胞因子CCL3L1基因拷貝值中國漢族健康人和HIV-1感染者中的分布特點，以期闡明趨化性細胞因子CCL3L1基因拷貝值與HIV-1易感性的相關性。 (2)克隆人趨化因子CCL3L1基因，表達并初步純化谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)-CCL3L1融合蛋白。 (3)HIV-1輔助受體CCR5配體人趨化因子CCL3L1進行果蠅Schneider-2細胞融合蛋白表達，純化后活性分析。 方法

2、 (1)選擇HIV/AIDS患者81例和健康者97例，實時定量PCR法檢測趨化性細胞因子CCL3L1基因拷貝值。bDNA法檢測HIV/AIDS患者的血漿病毒載量，同時用流式細胞儀檢測外周血CD<,4><'+>T細胞數(shù)量。 (2)從MCF7細胞中提取總RNA，采用RT-PCR擴增CCL3L1 cDNA基因，克隆入GST融合表達載體PGEX-4T中，重組載體經(jīng)酶切和測序鑒定后，在BL21大腸桿菌中用IPTG誘導表達，獲得GS

3、T-CCL3L1融合蛋白，采用SDS-PAGE和Westemblot分析表達產(chǎn)物。 (3)克隆人類CCL3L1 cDNA，構建CCL3L1表達載體pMT/BiP/His，獲得S2果蠅細胞表達的His-CCL3L1融合蛋白，同時克隆TpCDNA3．1-flag-CCR5表達載體，培養(yǎng)了穩(wěn)定表達flag-CCR5的細胞株，以檢測表達的人趨化因子CCL3L1活性。 結果 (1)中國漢族健康人群的CCL3L1平均基因拷貝

4、值為1，應用logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)低于漢族健康人群平均拷貝數(shù)者有較高的易感性(OR值為0.501)；應用spearman相關分析，HIV/AIDS人群CCL3L1基因拷貝值與病毒載量呈密切負相關性(p=0.000)，HIV/AIDS人群CCL3L1基因拷貝值與CD4T細胞計數(shù)密切正相關(p=0.000)。 (2)經(jīng)測序、酶切鑒定證明CCL3L1基因已正確插入到PGEX-4T-1中，經(jīng)IPTG誘導后，表達出相對分子質量為34

5、000的新生GST-CCL3L1融合蛋白。 (3)成功構建人趨化因子CCL3L1融合蛋白真核表達載體pMT/BiP/His，表達并純化出CCL3L1融合蛋白，免疫沉淀法檢測和westem blot法分析發(fā)現(xiàn)純化的CCL3L1融合蛋白能特異性結合CCR5受體，CC13L1融合蛋白在濃度1 nmol/1到50 nmol/1存在劑量依賴性，濃度50nmol/1到100 nmol/1沒有劑量依賴性。 結論 (1)趨化性細