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文檔簡介
1、研究背景及目的: 1998年Martinez-Martinez等最早發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌UAB1上存在質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥機制(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance,PMQR)。Qnr通過與DNA回旋酶及拓撲異構(gòu)酶Ⅳ結(jié)合而抑制環(huán)丙沙星的作用從而導致大腸埃希菌J53接合子的耐藥性升高。不少研究顯示qnr在全球范圍內(nèi)存在。迄今已發(fā)現(xiàn)qnr多個亞型,如qnrA、qnrB、qnrS、qnrC。200
2、6年美國學者發(fā)現(xiàn)的qnrB是一種全新的基因型,與qnrAl的核苷酸同源性僅為49.5%(氨基酸同源性39.5%),其分布有待研究,來源尚不清楚。目前僅印度、美國、臺灣和韓國有關(guān)于檢出qnrB的報道,qnrB常與產(chǎn)SHV-12、C17X-M-15、IMP-8與DHA等β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細菌密切相關(guān)。我們對2005年10月至2006年4月間我院分離的120株頭孢菌素耐藥的腸桿菌科細菌進行PCR檢測、接合驗證等以研究qnrA、qnrB的分
3、布,同時對qnr陽性菌株產(chǎn)SHV或CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶的情況進行初步分析,從而為PMQR的進一步研究提供實驗依據(jù)。 方法: 1.細菌的鑒定和藥敏采用Microscan Walkaway 40<'R>全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。 2.采用堿裂解變性法(E.Z.N.A<'TM> plasmid mini Kit)提取細菌質(zhì)粒DNA,PCR法檢測qnr的存在,qnrA和qnrB的引
4、物分別為A-F(5’-ATTTCTCACGCCAGGATTTG)、A'R(5’-GAGATTGGCATTGCTCCAG T)及Mrq1、MFQ2,產(chǎn)物大小分別為413bp、469bp,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、成像。每次均設陽性對照和陰性對照,參考菌株K.pneumoniae UAB1(qnrA)及E. coli J53 plus pMG298(qnrB)由上海華山醫(yī)院抗生素研究所王明貴教授和美國Lahey Clinic的G.A.
5、Jacoby教授饋贈。 3.接合實驗驗證qnr的轉(zhuǎn)移性,受體菌為E coli J53(Azide resistant),對接合子的選擇采用含1 00μg/mL氨芐西林、100μg/mL疊氮鈉、8μg/mL頭孢噻肟的胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA),將接合子分別接種至含與不含0.06μg/mL環(huán)丙沙星的TSA平板上觀察喹諾酮類藥物耐藥性的轉(zhuǎn)移。 4.比較受體菌、供體菌及接合子的MIC值,包括多種喹諾酮類藥物,采用瓊脂對倍稀釋法。
6、 5.PCR法分別檢測qnrA、qnrB陽性菌株orf13或orf1005的存在。采用引物qnrB/B’-CDS擴增qnrB的全序列,由Invitrogen公司采用ABIPRISM<'TM> 3730XL DNAAnalyzer測序,結(jié)果于www.ncbi.nlm.nih.gov上進行GenBank+EMBL+DDBJ比對。 6.對來自同一患者的不同菌種進行檢測以了解qnr在體內(nèi)是否存在水平傳播。一株鮑曼不動桿菌同時包含
7、qnrA、qnrB,純化PCR產(chǎn)物后連接到pMD-18T載體上,轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α感受態(tài)細胞內(nèi),采用抗生素平板篩選單克隆菌落。對經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆,提純質(zhì)粒DNA完成測序。 7.采用Nitrocefin法檢測供體菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況,改良三維實驗了解細菌產(chǎn)酶表型,Multiplex-PCR法檢測blasnv、blacTX-M及多種質(zhì)粒型AmpC酶的bla基因(包括DHA、MOX、CIT、ACC、FOX等)。
8、 結(jié)果: 1.qnr的檢出:120株腸桿菌科細菌中,分別有37株含qnrA,33株含qnrB,其中13株同時檢出qnrA、qnrB;其中腸桿菌屬、克雷伯菌屬細菌及大腸埃希菌qnr的檢出率分別為52.9%、57.1%和50.0%。 2.接合實驗:除一株肺炎克雷伯菌外其余56株接合子均能在TSA選擇平板上生長;而一株接合子在含環(huán)丙沙星的TSA上不能生長。 3.MIC測定:各種抗菌藥物對接合子的MIC值較受體菌均有
9、不同程度提高。僅加替沙星、頭孢吡肟對qnr陽性菌株的抗菌活性相對較好。 4.orf513及orf1005檢測:qnrA、qnrB陽性菌株中各有7株檢測到orf513或D饑005的存在。 5.qnrB全序列擴增:18株細菌可擴增出681bp或645bp的全序列片段。部分菌株的qnrB序列與qnrBl(DQ351241)完全一致,但4株細菌的qnrB序列與qnrB3(DQ303920)相比,存在3個位點核苷酸序列突變(201
10、 A→T,271位T→G,498位G→A)而導致相應編碼蛋白的氨基酸存在兩個位點差異:第67位、91位分別由賴氨酸、絲氨酸變成天冬酰胺及丙氨酸(K67N,S91A)。 6.qnr在患者體內(nèi)水平傳播:5個患者在首次檢出qnr后,相同患者后續(xù)分離到的其它菌種中(7株/5人),僅1株不含qnr基因。且對于同一患者,后續(xù)分離到的菌株與首次檢出株含有同一類型的qnr,也可能同時包含qnrA、qnrB。鮑曼不動桿菌的qnrB部分序列與qnr
11、B1完全一致,qnrA部分序列與qnrAl相比有一個核苷酸改變(167位C→T)。 7.供體菌β-內(nèi)酰胺酶檢測:所有細菌均可使Nitrocefin紙片變紅色;33株細菌產(chǎn)ESBls或AmpC酶。49株(89.1%)供體菌包含bla<,SGW>或blacTX-M;約70.0%的qm’陽性菌可檢測到AmpC β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)的bla基因,以DHA型及MIR-1T、ACT-1型為主。 結(jié)論: 1.2005年10月-20
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