胃癌中調(diào)節(jié)性T細胞異常增高的意義及機制研究.pdf

1、目的:CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是機體重要的免疫調(diào)節(jié)功能細胞，能下調(diào)免疫反應(yīng)維持機體免疫耐受，它在腫瘤免疫、移植免疫和自身免疫病中均發(fā)揮重要作用。但Treg 細胞在胃癌不同類型組織的表達情況及增高機制尚未闡明。通過本研究擬探討：建立體內(nèi)調(diào)節(jié)性T 細胞準確的檢測方法；研究調(diào)節(jié)性T 細胞在不同分期胃癌患者外周血、腹水、腫瘤組織、癌旁淋巴結(jié)等不同部位的分布特點及意義；初步探索調(diào)節(jié)性T 細

2、胞在胃癌中特異性增高的機制。從而進一步揭示免疫逃逸機制及發(fā)掘Treg 細胞潛在的臨床應(yīng)用價值。 方法:利用Foxp3 特異的單克隆抗體和Treg 細胞膜表面特性，分別建立Foxp3-FITC 、CD25-PE 、CD4-PerCP 、CD3-APC 及CD25-FITC 、CD127-PE 、CD4-PerCP、CD3-PC7 兩種4 色流式細胞術(shù)檢測Treg 細胞的方法，比較二者同一性。應(yīng)用流式細胞術(shù)分選Treg 細胞，RT

3、-PCR 檢測Foxp3 mRNA 的表達，探討Foxp3mRNA 和蛋白水平的一致性。應(yīng)用Foxp3 胞漿染色和CD25，CD127 膜表面染色流式細胞術(shù)，檢測60 例不同分期胃癌患者外周血、腹水、腫瘤組織、癌旁淋巴結(jié)、正常組織中Treg 的表達情況，Real Time RT-PCR 技術(shù)檢測外周血Foxp3 mRNA 水平表達情況。收集39 例不同分期胃癌患者血清和腹水上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測TGF-β1、PG

4、E2、IFN-γ、IL-4 等細胞因子的表達水平，研究胃癌免疫狀態(tài)及抑制因子在Treg 細胞增高的作用。 結(jié)果:1． Treg 細胞不同水平檢測方法學的確立：建立鑒定Foxp3 mRNA 的反轉(zhuǎn)錄PCR 體系；建立應(yīng)用Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-APC 及CD25-FITC/CD127-PE/CD4-PerCP/CD3-PC7 兩種4 色流式細胞術(shù)檢測Treg 細胞的方法；應(yīng)用Fxop3

5、胞漿染色與CD25high CD127low 膜表面染色鑒定Treg 細胞具有一致性（相關(guān)系數(shù)r＝0.983，P<0.01）；Treg 細胞特異性基因Foxp3 的mRNA 和蛋白水平均有表達。2．不同分期胃癌患者外周血、腹水、腫瘤組織、癌旁淋巴結(jié)等組織中調(diào)節(jié)性T 細胞的表達：應(yīng)用相對定量Real Time PCR 方法對外周血Foxp3 mRNA 進行檢測，發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者外周血中Foxp3 的表達高于正常對照（P<0.05），F(xiàn)oxp

6、3mRNA 表達量隨著腫瘤進展而升高，TNMⅠ病人外周血Foxp3 mRNA 即有顯著增高；流式細胞術(shù)檢測各期胃癌外周血Treg 細胞占CD4+ T 細胞的比例顯著高于正常對照（P<0.05），正常組織未見淋巴細胞浸潤。腹水、腫瘤、淋巴結(jié)中都存在較高水平的Treg 細胞；在外周血和腹水組織中，CD25+與Foxp3+的相關(guān)系數(shù)為-0.052，二者無相關(guān)性；而CD25high 與Foxp3+的相關(guān)系數(shù)達到0.731，P<0.01，二者顯著

7、相關(guān)，在腫瘤組織和癌旁淋巴結(jié)中，CD25+與Foxp3 的相關(guān)系數(shù)為0.807，P<0.01，二者顯著相關(guān)；CD25high 與Foxp3 的相關(guān)系數(shù)為0.608，P<0.01，二者顯著相關(guān)；各組織類型的調(diào)節(jié)性T 細胞占CD4+T 細胞的比例呈現(xiàn)出下列模式：腫瘤組織>癌旁淋巴結(jié)>腹水組織>外周血>健康對照外周血；胃癌早期患者外周血中調(diào)節(jié)性T 細胞的數(shù)目相比正常對照未現(xiàn)差異，晚期相比早期顯著增加（P<0.05）；在腹水和腫瘤組織中，Tre

8、g 細胞在晚期患者相比早期有顯著升高（P<0.05）；在癌旁淋巴結(jié)中，調(diào)節(jié)性T 細胞的數(shù)目在TNM 各期均未見顯著差異。3．不同分期胃癌患者血清和腹水上清中細胞因子的表達：IFN-γ在患者腹水上清的表達與正常對照相比，顯著升高（P<0.05），晚期患者相比早期患者，IFN-γ表達水平顯著下降，（P<0.05）；各期胃癌患者血清和腹水中IL-4 的表達相比對照顯著上升（P<0.05），晚期與早期相比，腹水上清中IL-4 表達水平顯著下降，

9、（P<0.05）； IFN-γ/ IL-4 在患者體內(nèi)相比健康對照顯著下降（P<0.05），晚期相比早期無顯著差異；TGF-β1 在各期胃癌血清和腹水上清相比正常對照顯著下降（P<0.05），晚期相比早期，血清TGF-β1 顯著上升（P<0.05），晚期患者TGF-β1 水平與Treg 細胞顯著相關(guān)（ P<0.05 ）；各期胃癌患者腹水PGE2 的表達水平相比正常對照顯著上升（ P<0.05 ），晚期患者與早期相比，腹水上清中PGE2

10、表達水平顯著上升（P<0.05），各期患者PGE2 水平與Treg 細胞水平顯著相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論:（1）CD4+CD25+Foxp3+T 細胞是體內(nèi)獨特的調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）亞群，CD4+CD25high CD127low 表面標記與CD4+CD25+Foxp3+相一致，可作為有效膜標志鑒定、篩選Treg 細胞。（2）胃癌患者相比健康人體內(nèi)存在高水平的Treg 細胞，Treg 細胞在腫瘤局部分布數(shù)量大于外周組

11、織，具體數(shù)量在各組織類型呈現(xiàn)出固有模式：腫瘤組織>癌旁淋巴結(jié)>腹水組織>外周血。（3）不同分期胃癌患者外周血、腹水、腫瘤組織、癌旁淋巴結(jié)中Treg 細胞相對含量隨腫瘤進展逐漸升高，Treg 細胞相對含量與胃癌分期關(guān)聯(lián)密切，有助于我們進行胃癌進展判斷。（4）腫瘤局部與外周組織中的Treg 細胞表面標志存在差異，腫瘤局部組織為CD4+ CD25high T 細胞，在外周則表現(xiàn)為CD4+ CD25+ T 細胞。（5）胃癌患者免疫狀態(tài)發(fā)生混亂，