轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1調(diào)控Snail表達(dá)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移力的作用研究.pdf

1、第一部分、TGF-β1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移力及Snail表達(dá)的影響。 目的：研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）遷移力、對(duì)Snail及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以探討TGF-β1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移力的影響及機(jī)制。 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，用免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)第3代的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用改良的Transwell小

2、室檢測(cè)不同濃度TGF-β1對(duì)細(xì)胞遷移力的影響；在同一濃度TGF-β1作用下，RT-PCR檢測(cè)MSCs細(xì)胞Snail及MMP-2 mRNA表達(dá)，Western blot及免疫熒光檢測(cè)Snail蛋白表達(dá)，以及明膠電泳酶譜法分析上清液中MMP-2活力變化。 結(jié)果：密度梯度離心結(jié)合貼壁法能有效分離、純化大鼠MSCs，免疫熒光檢測(cè)顯示培養(yǎng)的細(xì)胞CD29、CD44表達(dá)陽性，而CD34、CD45表達(dá)陰性。外源性TGF-β1對(duì)MSCs遷移力的促

3、進(jìn)作用具有劑量依賴性，在2 ng/ml時(shí)達(dá)到最高。MSCs同時(shí)表達(dá)Snail及MMP-2。在2 ng/mlTGF-β1刺激下，Snail mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高，MMP-2 mRNA及活力明顯增高，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.01或P<0.05）。 結(jié)論：TGF-β1可上調(diào)Snail及MMP-2表達(dá)，顯著提高M(jìn)SCs的遷移力。 第二部分、TGF-β1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Snail表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究。

4、 目的：研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和PI-3K/Akt信號(hào)通路在TGF-β1引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Snail表達(dá)改變中的調(diào)控作用。 方法：應(yīng)用Western blot檢測(cè)TGF-β1對(duì)P-ERK及P-Akt表達(dá)的影響以及以不同濃度ERK激酶特異性抑制劑（PD98059）或和PI3K通路特異性抑制劑（Wortmannin）干預(yù)后檢測(cè)MS

5、Cs細(xì)胞ERK、Akt磷酸化水平變化，確定PD98059和Wortmannin分別抑制Snail誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞ERK激酶和Akt激酶磷酸化的有效濃度，進(jìn)而用RT-PCR、Western blot技術(shù)研究其對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞Snail mRNA及蛋白水平影響。 結(jié)果：Western blot分析顯示TGF-β1作用6h后MSCs細(xì)胞p-Akt和p-ERK水平較對(duì)照組明顯增高；Wortmannin和PD98059可分

6、別以劑量依賴性抑制MSCs細(xì)胞p-Akt和p-ERK水平；可有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞ERK激酶及Akt激酶磷酸化的PD98059和Wortmannin相應(yīng)濃度分別為30 μmol/L和40 nmol/L。PD98059（30 μmol/L）、Wortmannin（40 nmol/L）明顯抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的Snail mRNA及蛋白水平，而兩者聯(lián)合給予對(duì)MSCs細(xì)胞Snail mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用具有協(xié)同作用，

7、與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：TGF-β1能促進(jìn)MSCs的Snail的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)，且ERK1/2及PI3K轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在此過程中具有調(diào)控作用。 第三部分、siRNA阻斷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Snail基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：研究體外化學(xué)合成siRNA在MSCs細(xì)胞中對(duì)目的基因Snail的干擾作用，建立利用RNA干擾技術(shù)研究基因功能的平臺(tái)。 方法：以陽離子脂質(zhì)體為載體，將化學(xué)

8、合成針對(duì)Snail基因的siRNA，轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞，在mRNA水平和蛋白水平評(píng)價(jià)siRNA對(duì)Snail基因表達(dá)的抑制作用。 結(jié)果：三條siRNA中，Y2鏈具有最佳干擾效果，自轉(zhuǎn)入細(xì)胞12小時(shí)起，在72小時(shí)內(nèi)，可有效抑制MSCs細(xì)胞Snail基因的表達(dá)，使Snail基因的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下降，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：siRNA可以在體外培養(yǎng)細(xì)胞中有效的沉默Snail基因，為研究基因

9、功能提供了一個(gè)快速、有效的系統(tǒng)。 第四部分、siRNA抑制Snail基因表達(dá)在TGF-β1調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移中的作用研究。 目的：以RNAi技術(shù)封閉MSCs細(xì)胞中Snail的表達(dá)，使外源性、一定濃度的TGF-β1刺激MSCs細(xì)胞Snail的轉(zhuǎn)錄受阻，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Snail在TGF-β1調(diào)控MSCs細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移中的作用。 方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染針對(duì)Snail基因的特異性小分子干擾RNA（siRNA），MT

10、T法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TGF-β1作用對(duì)細(xì)胞活力及細(xì)胞周期的影響，用改良的Transwell小室測(cè)定細(xì)胞遷移力，RT-PCR及明膠酶譜檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TGF-β1作用對(duì)MMP-2mRNA表達(dá)以及MMP-2活力的影響 結(jié)果：RNA干擾前MSCs在TGF-β1作用24h后平均每個(gè)200倍視野穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異有顯著性意義。RNAi后MSCs在TGF-β1作用24h后平均每個(gè)200倍視野穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比，