靶向生長抑素受體的磁共振分子探針的制備、表征及體外細胞實驗.pdf

1、第一章靶向生長抑素受體的磁共振分子探針的制備及表征
　　 目的：制備羧甲基葡聚糖改性的超順磁性Fe3O4納米粒子(CMD-MNPs)；采用化學方法將奧曲肽連接于CMD-MNPs上，制備連接了奧曲肽的超順磁性Fe3O4納米粒子(CMD-MNPs-Oc)；探討制備的磁性納米粒子(CMD-MNPs、CMD-MNPs-Oc)的理化特性、磁特性及T2弛豫性能，初步分析其作為一種磁共振成像T2對比劑的可行性。
　　 方法：采用超聲預

2、處理技術，在羧甲基葡聚糖-水分散體系中，通過化學共沉淀法制備羧甲基葡聚糖表面改性Fe3O4納米粒子(CMD-MNPs)，進一步將奧曲肽以酰胺鍵連接于該納米粒子上，制備連接了奧曲肽的超順磁性Fe3O4納米粒子(CMD-MNPs-Oc)。對制備的產(chǎn)品行紅外光譜(IR)分析、原子力顯微鏡(AFM)、透射電子顯微鏡(TEM)檢測、X射線衍射(XRD)分析、振蕩樣品磁強計(VSM)測定等方法進行表征，并采用1.5T磁共振成像儀行溶液的T2弛豫性能

3、(r2)測定。
　　 結果：制備的復合磁性納米粒子CMD-MNPs及CMD-MNPs-Oc呈球形，分散均勻，平均粒徑50nm，在水溶液中的穩(wěn)定性高；具有超順磁性，室溫下CMD-MNPs及CMD-MNPs-Oc的磁飽和磁化強度為35emu·g－1，測量的橫向弛豫效能r2分別為146.7s－1mM－1及173.6s－1mM－1。
　　 結論：成功制備了羧甲基葡聚糖改性的磁性納米粒子，并成功地以酰胺鍵將奧曲肽連接于該磁性納米粒

4、子上。制備的CMD-MNPs及CMD-MNPs-Oc均有較好的理化特性和磁特性并有良好的T2弛豫性能，可作為一種磁共振成像T2對比劑。
　　 第二章靶向生長抑素受體的磁共振分子探針的體外細胞實驗
　　 目的：對比制備的CMD-MNPs及CMD-MNPs-Oc內攝進入生長抑素受體陽性腫瘤細胞的差異性，以及MRI檢測這種差異的可能性。初步探討CMD-MNPs-Oc作為一種生長抑素受體靶向性磁共振分子探針的可行性。
　　

5、 方法：采用RT-PCR檢測BxPC-3人胰腺癌細胞的SSTR各亞型(SSTR1-5)mRNA的表達。BxPC-3細胞按常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將制備的CMD-MNPs、CMD-MNPs-Oc分別加入細胞的培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液中最終鐵濃度為35μg/ml，繼續(xù)共同培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)液中添加物不同，將細胞分為2組：靶向組為CMD-MNPs-Oc孵育后的BxPC-3細胞（實驗組）、非靶向組為CMD-MNPs孵育后的BxPC-3細胞（對照組）。分

6、別取上述2組細胞混懸液獲取細胞沉渣并經(jīng)多次離心、洗滌后行以下檢測：(1)將細胞沉渣固定，制作超薄切片并行電子染色，在日立JEOL-1230型透射電鏡下，觀察細胞內有無電子高密度顆粒物，并初步對比分析其在2組細胞內的量及部位等情況；(2)分別對2組的細胞涂片行常規(guī)HE染色及普魯士藍鐵染色，觀察細胞內鐵顆粒的吞噬情況，并定量對比分析2組吞噬鐵顆粒的陽性細胞百分比；(3)離心、洗滌后的細胞再重懸于新鮮無鐵培養(yǎng)液中，并分別調節(jié)細胞數(shù)至1.0×1

7、07個/ml，重懸后的各組細胞懸液裝入Ependoff管，并加入少量2％明膠避免細胞沉降，每組5管，對各個樣品及無細胞的新鮮無鐵培養(yǎng)液同時行1.5-T MRI掃描，采集其自旋回波序列T2加權圖像(TR5000 ms,TE100 ms)，對比各組重懸細胞液及無細胞的純培養(yǎng)液在T2加權圖像上信號強度的均值，并以無細胞的純培養(yǎng)液為參照，計算各組重懸細胞液在T2加權圖像上信號強度變化率。
　　 結果：經(jīng)RT-PCR檢測BxPC-3人胰腺

8、癌細胞的SSTR各亞型mRNA均為陽性表達。電鏡檢查示靶向組細胞內可見吞噬較多電子高密度顆粒，主要分布于胞漿內，并可見有小吞飲小泡形成；而非靶向組細胞內不見或偶見電子高密度顆粒，其少量電子高密度顆粒位于溶酶體內。細胞涂片HE染色示靶向組細胞的胞漿中見較多散在顆粒狀物，普魯士藍鐵染色示細胞的胞漿中有較多深色藍染顆粒，陽性細胞百分比為96.7％；而非靶向組細胞HE染色不見或偶見顆粒狀物，普魯士藍染色示細胞內不見或偶見深色藍染顆粒，陽性細胞百

9、分比僅為6.7％。靶向組細胞MRI掃描T2加權圖像信號強度明顯低于單純培養(yǎng)液的信號，其信號強度下降率為69.6％，靶向組信號強度也明顯低于非靶向組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 結論： BxPC-3細胞為一種SSTR1-5mRNA陽性表達細胞，能選擇性大量吞噬CMD-MNPs-Oc顆粒而幾乎不吞噬CMD-MNPs顆粒，提示CMD-MNPs-Oc分子上的奧曲肽對鐵顆粒的胞吞發(fā)揮至關重要的作用，CMD-MNPs-Oc