脊索細胞與椎間盤退變的相關性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分:兔腰椎間盤退變模型建立
   目的:纖維環(huán)損傷誘導椎間盤退變建立實驗動物模型。
   方法:新西蘭大白兔12只年齡2歲左右,體重2.0-3.5KG左右,雌雄不限。2只作為正常對照未行手術,其余10只進行手術制造椎間盤退變模型。
   手術采用10%水合氯醛3ml/kg耳緣靜脈注射麻醉、備皮、碘伏消毒、鋪巾。采用腰椎背側(cè)縱切口,椎旁肌腹側(cè)2cm,從胸廓下緣2cm至骨盆環(huán),脊柱L1-L6左前外側(cè)被暴露,鈍性

2、分離椎前軟組織,骨盆環(huán)作為L5/6間隙的標志。用18G針頭分別在L2/3、L4/5椎間盤進行穿刺,L3/4和L5/6作為自身對照。術后2、4、8、16、32周各隨機選取2只兔,行脊柱MRI檢查并行免疫組化及組織學觀察。結果:術后第3----10周造模后的椎間盤MRIT2WI信號呈現(xiàn)持續(xù)減弱趨勢,而內(nèi)對照非手術節(jié)段髓核信號強度在觀察期內(nèi)無明顯變化。各組椎間盤分級分值的變化顯示,從術后2周開始,穿刺椎間隙與自身內(nèi)對照椎間隙比較差異均有統(tǒng)計學

3、意義(P<0.05);穿刺髓核MRIT2相信號呈進行性下降,至術后16周呈快速下降。免疫組化及組織學觀察發(fā)現(xiàn)髓核細胞的數(shù)量及II型膠原含量較對照間盤進行性減少(P<0.01)。
   結論:纖維環(huán)穿刺誘導兔椎間盤退變的動物模型能再現(xiàn)IDD發(fā)展的客觀規(guī)律而且模型制作簡單、重復性好。
   第二部分:不同年齡組兔推間盤細胞分布類型研究
   目的:分析脊索細胞和軟骨樣細胞細胞形態(tài)及隨年齡增長時的分布情況
  

4、 方法:取3月齡組和3年齡組新西蘭大白兔各5只,完整取出腰椎脊柱.兔腰椎椎間盤纖維環(huán)橫行切開,完整取出髓核,放入petri培養(yǎng)皿,PPS洗液調(diào)制PH7.21%低熔點的瓊脂糖覆蓋,覆蓋、固走組織,然后植入10%的中性福爾馬林中固定,對于髓核和纖維環(huán)邊緣不清的三度退變椎間盤,用6mm直徑的穿刺針取出椎間盤中央部分,瓊脂糖包埋的髓核。熒光抗淬滅封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡下測量細胞大小以及CD44和vimentin在脊索細胞和軟骨樣髓核細胞內(nèi)

5、表達的平均熒光強度。
   結果:應用共聚焦顯微鏡,可以在新西蘭大白兔椎間盤髓核標本中,發(fā)現(xiàn)兩種細胞:脊索細胞和軟骨細胞。兩種細胞在大小上有明顯的區(qū)別,在3月齡新西蘭大白兔的椎間盤中,脊索細胞占主要部分。從細胞計數(shù)上分析,脊索細胞占全部的80.92%,與軟骨樣髓核細胞數(shù)量有著明顯的差異:在3年組新西蘭大白兔的椎間盤中,軟骨樣髓核細胞占主要部分,而脊索細胞數(shù)量較3月組明顯減少,比例為32.8%,表明脊索細胞數(shù)量隨年齡的增長而遞減,

6、軟骨樣髓核細胞的數(shù)量隨年齡遞增。Vimentin和CD44平均熒光強度在脊索鈿胞內(nèi)陰顯高于軟骨樣髓核細胞,兩者相比有顯著統(tǒng)計學意義。
   結論:脊索細胞內(nèi)這兩種蛋白的表達強度顯著高于軟骨樣髓核細胞(P<0.01)且與年齡呈負相關,年齡越小,表達越強。提示隨著脊索細胞成熟和老化,與脊索細胞調(diào)控和發(fā)揮功能相關的蛋白表達量逐漸下降。其對周圍環(huán)境發(fā)揮作用亦逐漸減少。
   第三部分:脊索細胞在兔椎間盤退變過程中的作用和轉(zhuǎn)歸

7、r>   目的:對脊索細胞在椎間盤退變過程中的作用的研究
   方法:新西蘭大白兔28只,分3月齡和3年齡兩組,每組共14只,3月齡組體重1.5±2.0kg,3年齡組體重3.0-4.5kg左右,雌雄不限。每組中有2只作為正常對照未行手術。每組其余12只進入手術制造椎間盤退變模型。術后2,4,8,16,24周行MRI影像學確認椎間盤退變后,經(jīng)耳緣靜脈注入空氣10mL處死實驗動物,獲取手術節(jié)段和正常自身對照的椎間盤髓核組織,手術節(jié)

8、段髓核作為退變組,自身未作處理間隙作為對照組。取下的髓核組織分成兩部分,一部分行免疫組織切片后進行HE染色與aggrecan,II型膠原和PCNA染色,免疫組織化學染色觀察。另一部分-70度保存,RT-PCR檢測。
   結果:椎間盤退變模型顯示脊索細胞逐漸消失,被軟骨樣髓核細胞和不規(guī)則的基質(zhì)取代,3月組兔椎間盤退變模型,前16周脊索細胞PCNA陽性細胞表達率基本保持穩(wěn)定,16周后顯著減少,軟骨樣髓核細胞的PCNA陽性細胞表達率

9、16周后逐漸增多。3年組脊索細胞PCNA陽性細胞表達率前8周逐漸增高,后逐漸下降;軟骨樣髓核細胞PCNA陽性表達細胞率前4周基本保持穩(wěn)定,8周后逐漸增高。
   結論:實驗兩個年齡組在出現(xiàn)蛋白多糖和II型膠原RT-PCR水平下降.MRIT2像信號出現(xiàn)明顯降低后,術后相同時間點3月齡組組織學觀測較3年組存在較多的脊索細胞,雖然該細胞在PCNA和aggrecan蛋白水平表達兩組無顯著差異,但髓核細胞PCNA和aggrecan蛋白水平

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