椎間盤器官整體培養(yǎng)條件下髓核組織的變化.pdf

1、椎間盤退變是慢性下腰痛及脊柱功能損害的重要原因。由椎間盤退變可引起如椎間盤突出癥、椎管狹窄癥、脊柱滑脫癥等一系列嚴重的臨床疾患，90％以上的脊柱手術與椎間盤退變有關。
　　 椎間盤退變的病因?qū)W十分復雜，危險因素頗多，我們對它的研究也在逐步的深入。有許多實驗方法和實驗模型被應用于研究椎間盤的功能，這些實驗模型包括在體動物模型及細胞離體培養(yǎng)模型等。在動物模型中，椎間盤退變通常由力學或化學方法誘導，但它不利于探究與細胞及基質(zhì)代謝有關的

2、疾病和信號傳導方面的問題；許多研究者利用體外細胞培養(yǎng)進行研究，但失去細胞基質(zhì)的細胞會發(fā)生分化或喪失功能，達不到研究的目的。
　　 如果能建立一種椎間盤器官整體培養(yǎng)的方法，就可以確保髓核細胞及其周圍基質(zhì)環(huán)境的完整，使細胞與細胞間、基質(zhì)內(nèi)部及細胞與基質(zhì)間的相互作用成為可能，有利于細胞表型及功能的表達，還為研究基質(zhì)間信號的傳導和椎間盤對外界刺激的反應創(chuàng)造了一個實驗平臺，在椎間盤退變研究方面有一定優(yōu)勢，所以有必要椎間盤器官整體培養(yǎng)方法作

3、相關探討。
　　 第一章：體外培養(yǎng)椎間盤器官
　　 目的：
　　 對大鼠椎間盤包括上下軟骨終板、纖維環(huán)及髓核組織進行整體培養(yǎng)，觀察髓核組織的變化，探索椎間盤器官整體培養(yǎng)的實用技術。
　　 方法：
　　 1、取健康清潔級SD大鼠60只，5-6周齡，150g左右，無菌條件下完整取出腰段椎間盤器官（包括髓核組織、纖維環(huán)、上下軟骨終板及少量附著于終板的松質(zhì)骨）共350個，隨機分為5組；
　　 2、

4、無菌條件下高滲肝素鹽水沖洗椎間盤3次，2.5倍放大鏡下進一步修整后置入12孔培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，高滲DMEM/F12培養(yǎng)液通過每1000ml等滲培養(yǎng)液內(nèi)加入3.72克NaCL獲得，小牛血清濃度：20％，每天換液一次；
　　 3、任選10個椎間盤器官，隨機分為兩組，對照組5個椎間盤在培養(yǎng)前置入液氮內(nèi)浸泡3次，每次浸泡1分鐘左右，隨后在兩組椎間盤的培養(yǎng)液內(nèi)均加入濃度為10mg/ml的NBT液240μl，吹打混勻，

5、培養(yǎng)8小時后取出兩組椎間盤，高滲鹽水沖洗3次，10％福爾馬林固定48小時，石蠟包埋，切片觀察；
　　 4、任取75個椎間盤，隨機分成5組，每組15個椎間盤，分別在培養(yǎng)的第0、3、7、14、21天取出1組椎間盤，高滲鹽水沖洗3次，10％福爾馬林固定48小時，石蠟包埋，切片觀察；取出椎間盤前8小時在培養(yǎng)液內(nèi)均加入濃度為10mg/ml的NBT液240μl，吹打混勻；
　　 5、任取10個椎間盤，隨機分為5組，每組2個椎間盤，分

6、別在在培養(yǎng)的第0、3、7、14、21天取出1組椎間盤，高滲鹽水沖洗3次，10％福爾馬林固定48小時，石蠟包埋，切片，厚度4-6μm，免疫組織化學染色觀察；
　　 6、任取75個椎間盤，隨機分成5組，每組15個椎間盤，分別在培養(yǎng)的第0、3、7、14、21天取出1組椎間盤，高滲鹽水沖洗3次，10％福爾馬林固定48小時，石蠟包埋，切片，厚度4-6μm，HE染色觀察；
　　 7、任取75個椎間盤，隨機分成5組，每組15個椎間盤，

7、分別在培養(yǎng)的第0、3、7、14、21天取出1組椎間盤，高滲鹽水沖洗3次，10％福爾馬林固定48小時，石蠟包埋，切片，厚度4-6μm，番紅O染色觀察；
　　 8、任取100個椎間盤，隨機分成4組，每組25個椎間盤，分別在培養(yǎng)的第0、3、7、14天取出1組椎間盤，高滲鹽水沖洗3次，無菌條件下剖開椎間盤，每5個椎間盤取出1組髓核組織，每組重量約250μg，Trizol試劑裂解細胞，PCR測試基質(zhì)蛋白表達。
　　 結果：

8、　　 1、可通過解剖獲得完整無損的SD大鼠椎間盤器官，但軟骨終板表面殘留少量松質(zhì)骨組織；
　　 2、NBT可對存活椎間盤細胞著色，而對死亡椎間盤細胞不著色；
　　 3、椎間盤器官體外培養(yǎng)兩周內(nèi)，髓核細胞成活率與對照組培養(yǎng)0天細胞成活率比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），培養(yǎng)21d時成活率顯著低于其余各時間點（P＜0.01）；
　　 4、器官培養(yǎng)各時間點免疫組織化學染色均顯示髓核細胞內(nèi)含大量Ⅱ型膠原；
　　

9、 5、椎間盤器官體外培養(yǎng)兩周內(nèi)，HE染色顯示髓核組織結構完整，培養(yǎng)21天組髓核組織結構分解，細胞散在分布，完整性消失；
　　 6、椎間盤器官體外培養(yǎng)兩周內(nèi)，番紅O染色顯示基質(zhì)結構完整，培養(yǎng)21天組顯示基質(zhì)染色不均勻，完整性消失，圖像分析結果顯示：培養(yǎng)14天內(nèi)各時間點灰度值比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，培養(yǎng)21天組與其他各時間點灰度值比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；
　　 7、隨著培養(yǎng)時間的延長，Ⅰ型膠原的mRNA

10、表達呈升趨勢，而Ⅱ型膠原、核心蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的mRNA表達呈下降趨勢，使用單因素方差分析結果顯示各組間相比差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1、NBT染料可用于鑒別器官培養(yǎng)條件下細胞成活與否；
　　 2、利用高滲培養(yǎng)液可對椎間盤器官進行整體培養(yǎng)，為椎間盤生理與病理研究提供了一種理想模型
　　 第二章：皮下埋植培養(yǎng)大鼠椎間盤器官的可行性研究
　　 目的：
　　 體內(nèi)皮下埋植培

11、養(yǎng)椎間盤器官的可行性研究
　　 方法：
　　 1、取健康清潔級SD大鼠32只，5-6周齡，150g左右，無菌條件下完整取出腰段椎間盤器官（包括髓核組織、纖維環(huán)、上下軟骨終板及少量附著于終板的松質(zhì)骨）160個，隨機分為6組；
　　 2、無菌條件下高滲肝素鹽水沖洗椎間盤3次，2.5倍放大鏡下進一步修整，置入含高滲培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，擱置于CO2孵箱內(nèi)備用；
　　 3、取健康清潔級SD大鼠16只，5-6周齡，150

12、克左右，5％水合氯醛麻醉，無菌條件下把已完整取出備用的椎間盤器官5個為1組埋植于麻醉大鼠背部皮下組織內(nèi)，待大鼠蘇醒后常規(guī)養(yǎng)殖；
　　 4、于培養(yǎng)的第3、7天各任選3只大鼠取出椎間盤器官15個，高滲鹽水沖洗3次，10％福爾馬林固定48小時，石蠟包埋，切片，厚度4-6μm，番紅O染色觀察；
　　 5、于培養(yǎng)的第3、7天各任選5只大鼠取出椎間盤器官25個，高滲鹽水沖洗3次，無菌條件下剖開椎間盤，每5個椎間盤取出l組髓核組織，每

13、組重量約250μg，Trizol試劑裂解細胞，PCR測試基質(zhì)蛋白表達。
　　 結果：
　　 1、培養(yǎng)3、7天組番紅O染色顯示基質(zhì)結構分解，染色極不均勻，圖像分析結果顯示培養(yǎng)0、3、7天組兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；
　　 2、隨著培養(yǎng)時間的延長，Ⅰ型膠原的mRNA表達呈上升趨勢，而Ⅱ型膠原、核心蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的mRNA表達呈下降趨勢。使用單因素方差分析結果顯示各組間相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0