胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的關(guān)鍵因子和Notch信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、腎臟疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的第三大主要疾病。急性損傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷后患者易發(fā)生多器官功能衰竭，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其死亡率高達(dá)45％[1]。研究顯示嚴(yán)重創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染和強(qiáng)應(yīng)激狀態(tài)下可以引起患者體內(nèi)細(xì)胞因子的瀑布樣釋放，呈現(xiàn)級聯(lián)放大作用。腎臟在應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中起重要作用，多器官功能障礙患者，一旦腎臟受累則預(yù)后明顯不良，由于超負(fù)荷的細(xì)胞因子釋放，多種應(yīng)激信號(hào)通路的過度開放，腎臟作為最容易被打擊的器官首先發(fā)生衰竭癥狀，激化全身各臟器功能衰竭，導(dǎo)致患者死亡[

2、2]。持續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)作為最主要的治療方法，其昂貴的治療費(fèi)用，和治療功能的局限，以及疾病本身的兇險(xiǎn)多變，使得治愈率一直在50％左右[1]。在對腎臟發(fā)育及固有細(xì)胞分化機(jī)制明確研究的基礎(chǔ)上，發(fā)展應(yīng)用細(xì)胞療法修復(fù)腎臟損傷，將成為急性腎損傷治療的一大重點(diǎn)和難點(diǎn)。為解決急性腎臟損傷的診治引入新的技術(shù)方案，具有重要的社會(huì)意義和科學(xué)意義。
　　 另一方面，全球有10％的患者罹受慢性腎臟疾病困擾，其中又有10％的患者進(jìn)展為慢性腎功

3、能不全[3]。患病率高，醫(yī)療費(fèi)用巨大，預(yù)后差，并且患者人數(shù)呈持續(xù)增長趨勢，造成了嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于慢性腎臟病病因復(fù)雜多樣，發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，對于慢性腎病的治療僅局限于對癥支持治療而沒有取得突破性的進(jìn)展。腎移植是目前治療終末期腎病(ESRD)最好方案。我國約有100萬慢性腎功能不全患者，每年新增12萬人，每年約有50萬患者需要腎移植[4]。然而每年全國可供移植的腎源僅有4000個(gè)，有的病人只能一邊做血透，一邊等待，不僅費(fèi)用巨大，

4、以每個(gè)患者每年5萬元的透析費(fèi)用計(jì)算，我國每年花費(fèi)在血液透析上的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)250億元人民幣[4]。而且許多人因?yàn)殚L期等不到供體，病情加重，最后喪失了移植的良機(jī)。腎移植隨著近年來移植免疫研究的不斷深入和新型免疫抑制劑的不斷問世，急性排異發(fā)生率顯著下降，一年移植物的存活率得到了明顯的提高，但其長期生存情況仍不樂觀，十年長期存活率目前只有50％-61％左右。目前直接針對腎臟疾病本身的研究，在發(fā)病機(jī)制和治療上均無突破性進(jìn)展，而又有研究表明人類三

5、分之一的慢性腎臟疾病與腎臟發(fā)育紊亂相關(guān)。因而從腎臟胚胎發(fā)育著手，研究腎臟正常發(fā)育的分子機(jī)制和信號(hào)通路，為闡明腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，提出新的干預(yù)治療修復(fù)策略已成為腎病領(lǐng)域的又一研究重點(diǎn)。
　　 本課題旨在研究后腎向腎臟固有細(xì)胞分化過程，明確期間起重要作用的Notch信號(hào)通路，闡明其信號(hào)傳導(dǎo)通路和分子機(jī)制。目的是為將來能夠修復(fù)腎臟損傷和體外構(gòu)建或克隆培育一個(gè)可供移植的腎臟奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分小鼠胚腎發(fā)育過程

6、中Notch信號(hào)通路關(guān)鍵基因篩選
　　 目的：嚴(yán)密觀察胚胎后腎間充質(zhì)向腎臟固有細(xì)胞分化過程，利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，篩選相關(guān)候選基因，即關(guān)鍵信號(hào)，進(jìn)一步探索腎小管胚胎發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)分子及分子調(diào)控機(jī)制，為闡明腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為將來能夠修復(fù)腎臟損傷和體外構(gòu)建或克隆培育一個(gè)可供移植的腎臟奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.采用清潔級健康雌性小鼠

7、BALB/c，雄性小鼠BALB/c，體重均為18～23g。將雌雄小鼠同籠受孕。在孕10.5天、孕12.5天、孕14.5天、孕16.5天和孕18.5天處死孕鼠，并獲取各孕期的小鼠胚胎腎臟組織進(jìn)行HE染色，嚴(yán)密觀察胚胎后腎間充質(zhì)向腎臟固有細(xì)胞分化過程。
　　 2.獲取孕12.5天、孕14.5天、孕16.5天和孕18.5天的小鼠胚胎腎臟組織，以高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，OligoGEArray基

8、因芯片篩選相關(guān)候選基因，即關(guān)鍵信號(hào)。針對芯片原始數(shù)據(jù)利用MultiClassDif工具進(jìn)行各分組間的差異基因篩選；篩選出的差異表達(dá)基因利用GeneFunNet工具構(gòu)建基因的功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)基因的功能屬性，計(jì)算目標(biāo)基因間屬性距離，根據(jù)屬性關(guān)系確定基因間作用方向，以此構(gòu)建基因-基因網(wǎng)絡(luò)，然后計(jì)算出各基因的網(wǎng)絡(luò)特征值，確定網(wǎng)絡(luò)中樞性調(diào)控基因。著重研究在胚胎腎臟發(fā)育起決定作用的時(shí)間段逗形期到S形期，也是腎臟固有細(xì)胞生成的重要時(shí)期，Notch信

9、號(hào)通路的重要作用，有助于我們鎖定候選基因。
　　 結(jié)果：通過對獲取的各孕期小鼠胚胎腎臟組織，進(jìn)行HE染色，觀察并驗(yàn)證了胚胎后腎間充質(zhì)向腎臟固有細(xì)胞分化過程，同時(shí)驗(yàn)證了獲取的胚腎組織各孕期的正確性。通過高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，OligoGEArray基因芯片篩選相關(guān)候選基因，得到三種表達(dá)趨勢變化的差異性表達(dá)基因。即E12.5、E14.5天表達(dá)量逐漸增加，到E16.5天表達(dá)量達(dá)到高峰，而E1

10、8.5天表達(dá)減少的基因ADAM10、MFNG；E12.5-18.5表達(dá)量逐漸增加的基因Pparg；E12.5-18.5天表達(dá)量逐漸減少的基因Ccnel。
　　 結(jié)論：利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法，進(jìn)一步探索腎小管胚胎發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)分子及分子調(diào)控機(jī)制，篩選獲得在胚胎腎臟發(fā)育逗形期到S形期起決定作用的時(shí)間段，也是腎臟固有細(xì)胞生成的重要時(shí)期2個(gè)特異性基因ADAM10、MFNG。

11、>　　 第二部分小鼠胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化中Notch信號(hào)通路關(guān)鍵基因的作用
　　 目的：
　　 1.從基因和蛋白質(zhì)水平分別驗(yàn)證利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法篩選獲得的相關(guān)候選基因在小鼠胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化中Notch信號(hào)通路的作用。
　　 2.使用ADAM10特異性抑制劑G1254023X拮抗金屬蛋白酶的作用，阻斷Notch信號(hào)通路，觀察其對胚胎后腎間充質(zhì)干

12、細(xì)胞向腎臟固有細(xì)胞分化的抑制作用。
　　 方法：
　　 1.采用清潔級健康雌性小鼠BALB/c，雄性小鼠BALB/c，體重均為18～23g。將BALB/c雌性小鼠與BALB/c雄性小鼠同籠受孕。在12.5天、14.5天、16.5天和18.5天數(shù)處死孕鼠，并取各孕期的小鼠胚胎腎臟組織。
　　 2.提取各孕期的小鼠胚胎腎臟組織的蛋白質(zhì)，使用Westernblot方法從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證利用高通量基因芯片(Notchsig

13、nalingpathway)方法篩選獲得的相關(guān)候選基因在小鼠胚胎腎臟組織的表達(dá)量。提取各孕期的小鼠胚胎腎臟組織的總RNA，使用RT-PCR方法從基因水平驗(yàn)證基因芯片篩選獲得的相關(guān)候選基因在小鼠胚胎腎臟組織的表達(dá)量。從而進(jìn)一步證明篩選獲得的相關(guān)候選基因在小鼠胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化中Notch信號(hào)通路的重要作用。
　　 3.分離培養(yǎng)原代E14.5天胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞，使用ADAM10特異性抑制劑G1254023X拮抗金屬蛋白

14、酶的作用，阻斷Notch信號(hào)通路，抑制胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞向腎臟固有細(xì)胞分化過程。并通過細(xì)胞免疫組化觀察檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物Pax-2、WT1，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、Cytokeratin8染色情況。
　　 結(jié)果：通過RT-PCR方法從基因水平、Westernblot方法從蛋白質(zhì)水平分別驗(yàn)證了ADAM10、MFNG基因E12.5、E14.5天表達(dá)量逐漸增加，到E16.5天表達(dá)量達(dá)到高峰，而E18.5天表達(dá)減少

15、。分離培養(yǎng)原代E14.5天胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞，ADAM10特異性抑制實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞免疫組化：間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物Pax-2、WT1陽性率藥物組較對照組低，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、Cytokeratin8陽性率藥物組較對照組低。
　　 結(jié)論：
　　 1.熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示小鼠胚胎腎臟發(fā)育的各時(shí)期，均能檢測到腎臟發(fā)育關(guān)鍵因子ADAM10、MFNG基因的表達(dá)。
　　 2.WesternBlot

16、檢測結(jié)果顯示小鼠胚胎腎臟發(fā)育的各時(shí)期，均能檢測到腎臟發(fā)育關(guān)鍵因子ADAM10、MFNG基因的蛋白表達(dá)。
　　 3.通過從基因及蛋白水平上驗(yàn)證，利用高通量基因芯片(Notchsignalingpathway)方法獲得ADAM10、MFNG這兩個(gè)基因在小鼠胚胎后腎間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的重要作用及其變化趨勢。
　　 4.使用體外ADAM10特異性抑制劑G1254023X拮抗金屬蛋白酶作用，可有效的阻斷Notch信號(hào)通路，抑制胚胎

17、后腎間充質(zhì)干細(xì)胞向腎臟固有細(xì)胞分化過程。驗(yàn)證了逗形期到S形期是胚胎腎臟發(fā)育起決定作用的時(shí)間段，也是腎臟固有細(xì)胞生成的重要時(shí)期。
　　 第三部分藥物干擾Notch信號(hào)通路對小鼠胚胎腎臟發(fā)育的影響
　　 目的：評價(jià)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱對胚胎腎臟發(fā)育的影響，并評估Notch2-Jagged1信號(hào)通路在此過程的重要作用
　　 方法：妊娠7.5-11.5天的母鼠予以連續(xù)皮下注射毒死蜱5mg/kg/day(6只)，對照組(6只)

18、注射生理鹽水。于妊娠16.5天處死母鼠，取胚胎腎臟組織、心臟組織、肝臟組織于福爾馬林固定，石蠟包埋切片。組織切片臟染色觀察兩組胚胎腎臟組織、心臟組織、肝臟組織形態(tài)學(xué)不同，并采用ABC法免疫組化鑒定兩組胚胎腎臟、心臟組織、肝臟組織Notch2、Jagged1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.正常小鼠胚胎腎臟在E16.5天時(shí)已形成S形體，并發(fā)育成具有腎單位并可能開始分泌尿液的原腎。HE染色發(fā)現(xiàn)CPF藥物處理組，胚胎腎臟發(fā)

19、育明顯遲緩，E16.5天時(shí)沒有出現(xiàn)S形體和腎單位。兩組胚胎肝臟均出現(xiàn)熟的肝細(xì)胞及成形的肝內(nèi)膽管，兩組組織形體學(xué)上未見到明顯異常。兩組胚胎心臟均已完成腔室分化、房室瓣形成，心肌細(xì)胞分化增殖使心壁致密變厚，兩組HE染色組織形體學(xué)上未見到明顯異常。
　　 2.免疫組化染色顯示正常妊娠16.5天的胚胎腎Notch2-Jagged1信號(hào)通路中的Notch2、Jagged1抗體表達(dá)也明顯比毒死蜱處理組強(qiáng)。兩組胚胎心臟、胚胎肝臟Notch2、