IGF-Ⅰ和PDGF-AA對體外培養(yǎng)大鼠髓核細胞的促增殖作用及兩者的比較.pdf

1、背景：自古以來腰腿痛就困擾著人們的生活，卻遲遲找不到真正原因。直到1934年，Mixter和Barr提出“椎間盤時代(Dynasty of the disc)”，人們才開始慢慢認識這一病變，對其的發(fā)生發(fā)展才開始進行進一步的研究。近幾年來，隨著組織工程學的研究也擴展到脊柱外科的領(lǐng)域，國外學者開展了組織工程椎間盤相關(guān)的基礎(chǔ)研究工作。雖然發(fā)表的研究報告數(shù)量尚少，然而卻反應(yīng)了本研究可喜的前景，不過關(guān)于體外培養(yǎng)的椎間盤細胞的研究及認識卻相對較少。

2、但由于細胞與組織培養(yǎng)技術(shù)具有較好的重復(fù)性、費用低、結(jié)果分析較簡單，無倫理問題等特點，使其在椎間盤退變研究中引起重視并不斷得到應(yīng)用。
　　 目的：隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，已開始涉及椎間盤退行性變這一領(lǐng)域。胰島素樣生長因子及血小板衍生生長因子以可溶解的結(jié)合蛋白形式存在，在軟骨形成和軟骨自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，具有改變椎間盤細胞外基質(zhì)變化和阻止椎間盤細胞凋亡的作用。我們通過體外培養(yǎng)大鼠椎間盤髓核細胞，觀察不同濃度胰島素生長因子及血小

3、板衍生生長因子對髓核細胞凋亡、增殖及細胞外基質(zhì)代謝的影響及兩者之間的差別，對進一步研究其對人體椎間盤的影響提供理論依據(jù)。
　　 方法：⑴分離并消化wistar大鼠椎間盤組織得到單個髓核細胞并完成原代細胞接種培養(yǎng)；⑵在原代細胞融合傳代后建立對照組、實驗組Ⅰ(1～4組，施加含1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml，1000ng/ml不同濃度胰島素樣生長因子的DMEM培養(yǎng)液)與實驗組Ⅱ(5～8組，施加含1ng/ml,10ng/

4、ml,100ng/ml，1000ng/ml不同濃度血小板衍生生長因子的DMEM培養(yǎng)液)；⑶在生長過程中使用倒置顯微鏡下觀察對照組和實驗組細胞形態(tài)、增殖的變化；⑷采用HE、甲苯胺藍染色法觀察傳3代的髓核細胞的增殖表現(xiàn)，使用免疫細胞化學染色法檢測各組Ⅱ型膠原的表達情況；⑸采用MTT(噻唑藍比色)法測定傳三代空白組和實驗組Ⅰ、Ⅱ中經(jīng)不同濃度因子刺激生長后的髓核細胞3、5、7天的吸光度值并繪制細胞生長曲線；使用流式細胞儀測定各組中處于S期(DN

5、A合成期)細胞含量；⑹經(jīng)統(tǒng)計軟件分析得出結(jié)論。
　　 結(jié)果：①在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察，10天后95％以上的細胞貼壁，原代細胞多為梭形，有偽足伸出；經(jīng)胰酶消化傳代后，細胞貼壁生長速度加快，而加入胰島素生長因子及血小板衍生生長因子刺激生長的髓核細胞生長繁殖能力明顯增強；②HE染色正常髓核細胞多呈梭形，胞漿豐富，有2個胞核。對照組在不含IGF-1或PDGF-AA刺激下，髓核細胞生長緩慢，細胞數(shù)量少，相互交叉連接少。而細胞形態(tài)的形態(tài)

6、趨向不規(guī)則，胞突明顯延長，呈細長索狀，胞漿含量減少，而IGF-1或PDGF-AA作用組的細胞，與對照組相比，生長因子組細胞的形態(tài)在培養(yǎng)早期(＜72h)變化不大，但在培養(yǎng)后期，可見細胞數(shù)量明顯比對照組多，細胞相互交叉呈網(wǎng)狀。細胞形態(tài)的形態(tài)多為為短梭形、多邊形，胞漿豐富。甲苯胺藍染色細胞核為紫色，胞漿染為深藍色。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色呈現(xiàn)陽性結(jié)果。③MTT法顯示吸光度值，第三天時4組、7組與其余組有差別(p＜0.05)，4、7組無差別；五

7、天時對照組、1、5組與其余各組組均有差別(p＜0.05)，對照組、1、5組無差別，7、8組與其他各組有差別(p＜0.05)，7、8組無差別；七天時對照組、1組、5組與其余各組組均有差別(p＜0.05)，對照組、1、5組無差別，2、4、6組與3組有差別(p＜0.05)，2、4、6組無差別，7、8組與其他各組有差別(p＜0.05)，7、8組有差別(p＜0.05)。④經(jīng)流式細胞儀檢測，生長因子的濃度與處于S期的細胞數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　

8、 結(jié)論：本實驗為髓核細胞的培養(yǎng)提供了簡單、有效的方法。髓核細胞在體外培養(yǎng)過程中，胰島素生長因子(IGF-1)及血小板衍生生長因子(PDGF-AA)能有效促進髓核細胞的增殖，且在有效濃度范圍內(nèi)，隨著濃度不斷增加，促進增殖作用顯著增加，細胞代謝與因子濃度呈線性關(guān)系。而在這兩種細胞因子的刺激比較中，在低濃度的情況下，PDGF-AA對細胞的促進作用與IGF-1無差別，但在高濃度的時候，培養(yǎng)初期無差別，而到培養(yǎng)后期的時候，PDGF-AA對細胞的