高碘對體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞損傷作用的研究.pdf

1、目的：
　　 通過觀察不同濃度碘對體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的增殖或凋亡作用，探討高碘對動脈血管的損傷作用及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞(A7r5)置于37℃，5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對照組和加碘組:加碘組根據(jù)碘濃度范圍(0.075～7500mg/L)分為22組，以空白作為對照組。連續(xù)培養(yǎng)12h、24h和48h后分別收集細(xì)胞待用。采用細(xì)胞計

2、數(shù)法檢測細(xì)胞數(shù)量;四唑鹽(Methylthiazolyltetrazolium，MTT)比色法測定細(xì)胞活性;瑞氏-吉姆薩染色(Wrigh-Giemastaining)觀測細(xì)胞形態(tài);吖啶橙熒光染色(Acridineorangstaining)觀測細(xì)胞凋亡形態(tài);AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscriptionpolymersadechainreaction，RT-PCR)檢測培

3、養(yǎng)細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因片段baxmRNA，bcl-2mRNA的表達(dá)水平;采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(WesternBloting)測定ASK-1和TRX-1蛋白的表達(dá)水平。統(tǒng)計方法:多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞計數(shù)
　　 加含不同濃度的碘培養(yǎng)液分別培養(yǎng)12、24、48小時。細(xì)胞培養(yǎng)12小時后，加碘組與對照組相比，碘濃度范圍為0.075～3750mg/L時，細(xì)胞

4、生長正常(P＞0.05)，碘濃度為5250mg/L時可以明顯抑制細(xì)胞的生長(P＜0.01)，抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)關(guān)系;細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，加碘組與對照組相比，碘濃度范圍為0.075～1500mg/L時，細(xì)胞生長正常（P＞0.05），碘濃度為3000mg/L時可以明顯抑制細(xì)胞的生長(P＜0.01)，抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)關(guān)系;細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，加碘組與對照組相比，碘濃度為0.075～1120mg/L時，細(xì)胞生長正常（P＞0.05）

5、，碘濃度為2250mg/L時可以明顯抑制細(xì)胞的生長(P＜0.01)，抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)。隨著碘濃度的升高，碘對細(xì)胞生長的抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)。
　　 2.MTT測定細(xì)胞活性
　　 將細(xì)胞置于不同濃度碘培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)12、24、48小時。細(xì)胞培養(yǎng)12h后，加碘組與對照組相比，碘濃度為2250mg/L時，細(xì)胞生長正常（P＞0.05），當(dāng)?shù)獾臐舛仍?750mg/L以上時，碘濃度為時可以明顯抑制細(xì)胞生長（P＜0.01

6、），抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)關(guān)系;細(xì)胞培養(yǎng)24小時后，加碘組與對照組相比，碘濃度為1500mg/L時，細(xì)胞生長正常(P＞0.05)。碘濃度為3000mg/L時可以明顯抑制細(xì)胞的生長（P＜0.01），抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)關(guān)系;細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，加碘組與對照組相比，碘濃度為600mg/L時，細(xì)胞的生長正常(P＞0.05)。碘濃度為1500mg/L時可以明顯抑制細(xì)胞活性(P＜0.01)，且抑制作用與碘濃度呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 3

7、.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 3.1.瑞士-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)
　　 與對照組比較，碘濃度為1500mg/L及以下時，細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯變化，從3750mg/L開始加碘組的細(xì)胞數(shù)量隨濃度增大而減少，平滑肌細(xì)胞收縮變形，細(xì)胞間隙增大。隨著濃度的升高，細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞呈星形及多邊型，出現(xiàn)“裸核”，甚至可見網(wǎng)狀的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。
　　 3.2.吖啶橙細(xì)胞染色觀察細(xì)胞形態(tài)
　　 與對照組比較，碘濃度為15

8、00mg/L及以下時，細(xì)胞沒有明顯變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。但是當(dāng)?shù)鉂舛仍龃蟮?750mg/L以上時，細(xì)胞形態(tài)逐漸不規(guī)則，細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞質(zhì)減少;細(xì)胞質(zhì)致密化，與周圍細(xì)胞聯(lián)系中斷;細(xì)胞核變形明顯，聚集在細(xì)胞邊緣。隨著碘濃度的升高，熒光碎片逐漸增多，在高濃度時可見凋亡小體。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率
　　 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度碘培養(yǎng)細(xì)胞48h后，與對照組相比，碘濃度為750mg/L時，細(xì)胞生存率明顯降低(P＜0.0

9、1);隨著碘濃度的升高，細(xì)胞生存率逐漸降低;碘濃度為750mg/L時，細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），隨著碘濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。
　　 5.碘對A7r5細(xì)胞中baxmRNA和bcl-2mRNA的表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度碘培養(yǎng)細(xì)胞48h后，碘濃度為750mg/L時，與對照組相比，baxmRNA和bcl-2mRNA表達(dá)變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;碘濃度為1500mg/L開始，bc

10、l-2mRNA表達(dá)逐漸減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);baxmRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)
　　 6.碘對A7r5細(xì)胞內(nèi)ASK-1和TRX-1蛋白的表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度碘培養(yǎng)細(xì)胞48h后，碘濃度為750mg/L時，與對照組相比，細(xì)胞的ASK-1和TRX-1蛋白表達(dá)水平均有顯著變化(P＜0.01)。隨著碘濃度的升高，ASK-1蛋白表達(dá)逐漸減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.

11、01);TRX-1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、一定濃度的碘對大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用，細(xì)胞活性降低，且呈時間-劑量關(guān)系;
　　 2、高濃度的碘可以使大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，并且可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;
　　 3、高濃度的碘可以導(dǎo)致大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡率升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;
　　 4、高濃度的碘不僅能夠增強(qiáng)促凋亡m