溫度影響體外培養(yǎng)大鼠精原細(xì)胞SCF-c-kit增殖通路及細(xì)胞周期.pdf

1、目的:通過在不同溫度下體外培養(yǎng)大鼠生精細(xì)胞,探討溫度對(duì)精原細(xì)胞SCF/c-kit增殖通路及細(xì)胞周期的影響,為進(jìn)一步研究體腔溫度(37℃)導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的機(jī)制提供基礎(chǔ)研究資料。
　　 方法:采用機(jī)械法和酶消化法分離雄性成年SD大鼠生精細(xì)胞,分別置于不同溫度(32℃、37℃)條件下與支持細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng),觀察其形態(tài)及細(xì)胞數(shù)變化等生長(zhǎng)特性:培養(yǎng)第8天利用非連續(xù)密度梯度離心、差異性貼壁分離富集A型精原細(xì)胞:流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:

2、實(shí)時(shí)定量.多聚酶鏈反應(yīng)(Realtime-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)和蛋白免疫印跡(WesternBlot)分別檢測(cè)SCF/c-kit增殖通路中c-kit及下游基因PI3K、CyclinD3mRNA和蛋白的表達(dá);Sanger雙脫氧法檢測(cè)c-kit基因第9、11、13號(hào)外顯子序列。
　　 結(jié)果:體外共培養(yǎng)第1天,32℃組、37℃組均可見懸浮的呈圓形或卵圓形的生精細(xì)胞和貼壁的呈長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形的支

3、持細(xì)胞;前3天,生精細(xì)胞數(shù)及生長(zhǎng)狀態(tài)沒有明顯的區(qū)別,從第4天開始,37℃組的生精細(xì)胞數(shù)、生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸降低,第4天時(shí),37℃組的生精細(xì)胞數(shù)為3.11±0.18×106/ml,32℃組為3.40±0.25×106/ml,第8天時(shí),37℃生精細(xì)胞數(shù)為0.49±0.25×106/ml,明顯低于32℃組的2.93±0.26×106/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):體外共培養(yǎng)第8天,percoll分離結(jié)合差速貼壁法成功分離富集出A型精原細(xì)胞

4、,流式結(jié)果顯示32℃組處于S期A型精原細(xì)胞所占比例為49.35±1.04,明顯高于37℃組的43.58±0.78;G0/G1期為40.99±0.76,明顯低于37℃組的46.45±0.92,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)時(shí)定量.多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)結(jié)果顯示:32℃組和37℃組A型精原細(xì)胞中均有c-kit、PI3K及CyclinD3mRNA和蛋白的表達(dá),且32℃組中A型精原細(xì)胞c

5、-kit、PI3K及CyclinD3mRNA和蛋白的表達(dá)量均高于37℃組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);基因測(cè)序結(jié)果顯示32℃組c-kit基因第9、11、13號(hào)外顯子均未見突變,37℃組第11、13號(hào)外顯子未見突變,第9號(hào)外顯子見套峰,提示在9號(hào)外顯子附近區(qū)域可能有缺失或插入突變。
　　 結(jié)論:在含有FBS的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中體腔溫度(37℃)影響體外培養(yǎng)大鼠精原細(xì)胞的增殖,同時(shí)可能導(dǎo)致c-kit基因發(fā)生突變;3