骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Cx43表達(dá)變化及其在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細(xì)胞在骨髓中異常增生的惡性腫瘤,這些異常增生的漿細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)。MM細(xì)胞與骨髓微環(huán)境可通過(guò)直接接觸及分泌細(xì)胞因子的方式間接相互作用。在MM的發(fā)展過(guò)程中,骨髓微環(huán)境逐漸表現(xiàn)出支持 MM細(xì)胞生存和增殖的特征。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)參與構(gòu)建骨髓微環(huán)境,參與促進(jìn) MM細(xì)胞的生長(zhǎng)及骨破壞的發(fā)生;同時(shí),MM細(xì)胞對(duì)骨髓微環(huán)境重塑使其成為適合MM細(xì)胞生存和增殖場(chǎng)所。目前,此過(guò)程中涉及的具體機(jī)制尚未完全闡明。<

2、br>　　間隙連接是普遍存在的一種細(xì)胞間連接方式,相鄰細(xì)胞間通過(guò)間隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接通訊(GJIC)進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換,對(duì)細(xì)胞增殖、分化等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用。間隙連接蛋白43(Cx43)是在人體表達(dá)最高的一種間隙連接物質(zhì),可在包括造血干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá),參與造血調(diào)控。Cx43表達(dá)及功能異常在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。那么在MM的發(fā)生、發(fā)展中, MM細(xì)胞及BMSCs如何相互作用,是否發(fā)生間隙連接

3、的表達(dá)或功能改變,其改變又有怎樣的生物學(xué)效應(yīng)?我們通過(guò)建立 MM細(xì)胞與 BMSCs的共培養(yǎng)體系,研究 MM細(xì)胞對(duì)BMSCs Cx43表達(dá)及功能的影響以及此過(guò)程中MM細(xì)胞及BMSCs的生物學(xué)行為的變化,從而進(jìn)一步探討MM的發(fā)病機(jī)制。
　　本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NO81071934/H1616)“接頭蛋白Cx43在多發(fā)性骨髓瘤成骨細(xì)胞巢重塑中的作用”的重要研究?jī)?nèi)容,該實(shí)驗(yàn)完成為此項(xiàng)目的結(jié)題、文章發(fā)表及延伸課題的申報(bào)奠定基礎(chǔ)。本

4、文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 Cx43在骨髓瘤細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)及生物學(xué)功能
　　目的:檢測(cè)人MM細(xì)胞及BMSCs的Cx43表達(dá),探討間隙連接在BMSCs誘導(dǎo)的MM細(xì)胞的遷移、粘附中的作用及其對(duì)BMSCs的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)分泌的影響。
　　方法:貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人BMSCs,CD138磁珠及midi MACs分選原代MM細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定BMSCs及原代MM細(xì)胞的免疫表型

5、。Westernblot及免疫熒光檢測(cè)Cx43在BMSCs的表達(dá)。CCK-8法檢測(cè)間隙連接阻斷劑18α-甘草次酸(18α-GA)對(duì)MM細(xì)胞及BMSCs增殖的作用;微孔隔離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)18α-GA對(duì)BMSCs誘導(dǎo)的MM細(xì)胞遷移、粘附能力的影響。ELISA檢測(cè)BMSCs SDF-1α分泌水平。
　　結(jié)果:1)MM細(xì)胞系RPMI8226、U266及1例原代MM細(xì)胞中、低度表達(dá)Cx43,XG-4、XG-7細(xì)胞不表達(dá)Cx43。BMSCs高表達(dá)C

6、x43。初診 MM患者的BMSCs(MM-MSC)Cx43表達(dá)高于正常供者的BMSCs(ND-MSC)。2)18α-GA對(duì)RPMI8226細(xì)胞和BMSCs的增殖無(wú)明顯影響。3)18α-GA抑制BMSCs的SDF-1α分泌,其作用前后SDF-1α濃度分別為(237.84±9.23)pg/ml、(94.31±6.44)pg/ml(P<0.01)。4)18α-GA可抑制BMSCs誘導(dǎo)的MM細(xì)胞遷移,BMSCs經(jīng)其作用前后RPMI8226細(xì)胞遷

7、移率分別為(8.0±0.673)％及(4.82±0.186)％(P<0.01),XG-7的細(xì)胞遷移率分別為(0.88±0.036)％、(0.58±0.020)％(P<0.05)。5)18α-GA可抑制MM細(xì)胞在BMSCs的粘附,其作用前后 RPMI8226細(xì)胞粘附率分別為(16.967±1.55)％、(11.1±0.819)％(P<0.05),XG-7的細(xì)胞粘附率分別為(9.5±1.323)％、(6.63±0.551)％(P<0.05)

8、。
　　結(jié)論:BMSCs及部分MM細(xì)胞表達(dá)Cx43, MM-MSC Cx43表達(dá)高于ND-MSC。阻斷間隙連接可抑制 BMSCs誘導(dǎo)的MM細(xì)胞的遷移和粘附,并可抑制BMSCs的SDF-1α分泌。
　　第二部分 三維BMSCs細(xì)胞球的建立及其特點(diǎn)觀察
　　目的:建立BMSCs的三維培養(yǎng)方法以模擬骨髓微環(huán)境,并觀察MM細(xì)胞在三維培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞球中的遷移。
　　方法:在瓊脂糖包被的圓底培養(yǎng)板中進(jìn)行BMSCs的三維

9、培養(yǎng),倒置顯微鏡、HE染色及電鏡下觀察三維培養(yǎng)的BMSCs(3D-BMSCs)的形態(tài)特點(diǎn),RT-PCR檢測(cè)3D-BMSCs和普通二維培養(yǎng)的BMSCs(2D-BMSCs)的Cx43 mRNA、SDF-1αmRNA的表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)18α-GA對(duì)RPMI8226細(xì)胞在3D-BMSCs細(xì)胞球中遷移的影響。
　　結(jié)果:BMSCs在瓊脂糖包被的圓底培養(yǎng)板中可呈球形生長(zhǎng),4天后細(xì)胞球直徑約450μm。細(xì)胞球石蠟切片HE染色示,細(xì)胞球外層多為

10、長(zhǎng)梭形細(xì)胞,內(nèi)部為多角形、不規(guī)則細(xì)胞。掃描電鏡示,BMSCs細(xì)胞及其胞外絲狀突起、基質(zhì)樣物質(zhì)形成細(xì)胞球的外層結(jié)構(gòu),外層BMSCs仍為長(zhǎng)梭形。與2D-BMSCs相比,3D-BMSCs的SDF-1αmRNA表達(dá)明顯升高,Cx43 mRNA表達(dá)無(wú)明顯差別;18α-GA可抑制RPMI8226細(xì)胞在3D-BMSCs細(xì)胞球中的遷移。
　　結(jié)論:3D-BMSCs細(xì)胞球在一定程度上可模擬骨髓微環(huán)境,其SDF-1αmRNA表達(dá)較2D-BMSCs明顯

11、升高,并且其Cx43表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)MM細(xì)胞的遷移有重要作用。
　　第三部分 MM細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)體系中Cx43表達(dá)變化及其生物學(xué)效應(yīng)
　　目的:觀察MM細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)體系中Cx43表達(dá)水平的變化及其對(duì)MM細(xì)胞及BMSCs生物學(xué)行為的影響。
　　方法:建立RPMI8226細(xì)胞和BMSCs的間接及直接共培養(yǎng)體系,用CD138磁珠分離直接共培養(yǎng)的RPMI8226細(xì)胞及BMSCs。實(shí)時(shí)定量PCR、Western bl

12、ot檢測(cè)共培養(yǎng)前后BMSCs的Cx43表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)Cx43分布;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)后BMSCs間隙連接通訊(GJIC)的變化;ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)前后BMSCsSDF-1α分泌水平變化。Western blot檢測(cè)共培養(yǎng)前后BMSCs的beclin、LAMP、LC3表達(dá)及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對(duì)共培養(yǎng)體系中BMSCs LC3及Cx43表達(dá)的影響。Vonkossa染色檢測(cè)RPMI8226細(xì)胞和3-MA對(duì)BMSCs成骨

13、分化的影響。
　　結(jié)果:1)直接或間接共培養(yǎng)后BMSCs的Cx43mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯提高,分別是單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的1.36倍和2.1倍。2)Western blot檢測(cè)示共培養(yǎng)后BMSCs Cx43蛋白表達(dá)水平也上調(diào),免疫熒光示增高的Cx43主要分布在胞質(zhì)。3)劃痕實(shí)驗(yàn)顯示在BMSCs與RPMI8226直接共培養(yǎng)后熒光染料在細(xì)胞間擴(kuò)散距離增加。4)與BMSCs直接共培養(yǎng)后,RPMI8226細(xì)胞Cx43表達(dá)降低,間接共培養(yǎng)后Cx43表

14、達(dá)無(wú)明顯變化。5)在BMSCs與RPMI8226細(xì)胞直接和間接共培養(yǎng)體系中,BMSCs培養(yǎng)上清SDF-1α水平分別為(373.02±10.11)和(309.71±10.71)pg/ml,均高于共培養(yǎng)前(237.84±9.23)pg/ml(P<0.01,P<0.05)。經(jīng)18α-GA作用后,直接和間接共培養(yǎng)體系中SDF-1α分別降為(126.01±4.80)(P<0.001)和(106.99±3.39)pg/ml(P<0.01)。6)RP

15、MI8226與BMSCs共培養(yǎng)48h后,BMSCs的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、beclin均較對(duì)照組升高,溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1也升高。3-MA抑制共培養(yǎng)體系中BMSCs的自噬水平,同時(shí)BMSCs的Cx43水平較前升高。RPMI8226細(xì)胞可抑制BMSCs的成骨分化,3-MA可減輕該抑制作用。
　　結(jié)論:MM細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)BMSCs Cx43的表達(dá)并增強(qiáng)BMSCs的GJIC,從而促進(jìn)BMSCs SDF-1α的分泌。MM細(xì)胞可通過(guò)上