不同尺度二氧化鈦納米顆粒的細(xì)胞毒性及其機制研究.pdf

1、鈦及鈦合金因具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，被廣泛地應(yīng)用為臨床骨植入體。但是，由于其固有的表面惰性，鈦基植入體只能通過機械鎖合方式與周圍骨組織整合。因此，在過去幾十年中，科研工作者通過調(diào)控適宜的鈦基材表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以期獲得高性能鈦基植入體。近年來，伴隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，利用納米表面工程化鈦基表面(納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu))調(diào)控細(xì)胞行為的研究備受關(guān)注。
　　然而，在長期臨床應(yīng)用（例如，鈦髖關(guān)節(jié)植入體）中，由于腐蝕、無菌性松動和假體摩擦，植入體

2、/骨界面不可避免地會產(chǎn)生微米級或納米級的磨損顆粒。本論文利用水熱法合成了不同尺度的二氧化鈦納米顆粒，模擬鈦合金植入體的納米級的磨損顆粒，進而研究磨損顆粒對成骨細(xì)胞、骨髓骨間充質(zhì)干細(xì)胞生長的影響，為研發(fā)新型鈦基植入體積累知識。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　1．不同尺度二氧化鈦納米顆粒的合成
　　利用水熱法合成了不同尺度的二氧化鈦納米顆粒。分別利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對一系列二氧化鈦納米顆粒的形貌進行了表征。結(jié)果

3、顯示，二氧化鈦納米顆粒具有均一的形態(tài)特征和較好的分散性。顆粒粒徑分布分別為:14±3 nm、39±8 nm、74±15 nm、108±23 nm、136±34 nm及196±50 nm。X射線衍射儀表征證實：二氧化鈦納米顆粒呈高結(jié)晶度，晶相結(jié)構(gòu)符合銳鈦礦相(PDF21-1272)。
　　2．200納米以下不同尺度二氧化鈦顆粒的細(xì)胞毒性與其尺度的相關(guān)性
　　為了評價鈦基全關(guān)節(jié)植入體產(chǎn)生的納米尺度磨損顆粒對細(xì)胞的影響，在本文中，

4、我們首先研究了不同尺度的二氧化鈦納米顆粒對成骨細(xì)胞生物功能的影響。細(xì)胞活力和堿性磷酸酶活性評價表明：納米顆粒的負(fù)效應(yīng)隨顆粒尺度的增加而增大(p<0.05，p<0.01)。利用透射電子顯微鏡、溶酶體染色和激光共聚焦顯微鏡檢測了納米顆粒對細(xì)胞形態(tài)的影響以及在細(xì)胞中的分布。結(jié)果表明：二氧化鈦納米顆粒僅存留于細(xì)胞質(zhì)中，而未進入細(xì)胞的細(xì)胞核中。利用吞噬抑制劑，我們進一步研究了不同納米顆粒內(nèi)吞機制。結(jié)果證實：不同尺度的納米顆粒進入細(xì)胞的內(nèi)吞作用的途

5、徑不同。最后，我們研究了不同納米顆粒對成骨細(xì)胞核受體激活核因子κB配體（RANKL）的表達、基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-9活性以及細(xì)胞凋亡的影響。研究證實：隨著顆粒粒徑的增加，負(fù)效應(yīng)也隨之顯著增加?？傊?，所有數(shù)據(jù)表明，銳鈦礦型TiO2納米顆粒對成骨細(xì)胞的負(fù)效應(yīng)隨顆粒尺度的增加而增大，為納米鈦基植入體的安全性評價提供了依據(jù)。
　　3.不同尺度二氧化鈦納米顆粒對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖、遷移和分化的影響
　　為進一步研究鈦基人工關(guān)

6、節(jié)植入體的納米尺度磨損顆粒對骨整合性的影響，我們從細(xì)胞水平到分子水平研究了不同TiO2納米顆粒（模型）對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的粘附、遷移、增殖和分化的影響。MSCs的活力、增殖以及細(xì)胞周期呈現(xiàn)與TiO2納米顆粒的尺度和使用的劑量相關(guān)(p<0.01)。利用激光共聚焦顯微鏡考察了細(xì)胞內(nèi)吞的納米顆粒對MSCs的粘附、鋪展及細(xì)胞形態(tài)的影響。研究結(jié)果證實，大尺度的TiO2顆粒嚴(yán)重破壞了MSCs的細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞骨架的鋪展和粘著斑蛋白。

7、Transwell分析和傷口愈合實驗證明：隨著TiO2納米顆粒尺度的增加，對細(xì)胞遷移的不利影響越嚴(yán)重。此外，堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白的基因表達以及礦化測試表明，大尺度的TiO2納米顆粒對MSCs的成骨細(xì)胞分化具有顯著的負(fù)面影響。本研究積累的知識可為設(shè)計新型納米結(jié)構(gòu)的鈦金屬植入體提供思路。
　　4.不同納米顆粒的表面特征及化學(xué)性質(zhì)對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響
　　本文中，我們合成了尺度為100 nm左右的三種納米顆粒（介孔 SiO

8、2、Fe3O4以及 TiO2顆粒）。納米顆粒的形貌、晶相以及表面電荷分別用掃描電子顯微鏡、X射線衍射儀及Zeta電位儀表征。進而，我們研究了不同納米顆粒的形貌和表面電荷對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。研究表明：當(dāng)納米顆粒的濃度小于0.20 mg/mL時，介孔SiO2和Fe3O4納米顆粒的劑量依賴毒性不明顯；但隨著培養(yǎng)時間的延長，對細(xì)胞的負(fù)效應(yīng)顯著增加。在高劑量(>0.20 mg/mL)情況下，不同納米顆粒對細(xì)胞的毒性表現(xiàn)出劑量和時間相關(guān)性。進一步