不同粒徑納米二氧化硅的細(xì)胞毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、納米SiO2是目前世界上大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)量最高的納米材料之一，廣泛應(yīng)用于塑料工程、殺菌劑、農(nóng)業(yè)及涂料等領(lǐng)域，人們?cè)谌粘９ぷ骱蜕钪薪佑|到納米SiO2的機(jī)會(huì)越來(lái)越多。納米材料的大小與較大蛋白質(zhì)的尺寸相當(dāng)，有可能通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散或滲透的形式通過(guò)肺血屏障和皮膚進(jìn)入體內(nèi)，易于透過(guò)生物膜上的孔隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基體和細(xì)胞核等細(xì)胞器內(nèi)，并與生物大分子發(fā)生結(jié)合或催化反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)一些激素和重要酶系的活性喪失。注入到氣管

2、內(nèi)的納米TiO2顆粒（3 nm）可通過(guò)破壞血腦屏障造成大腦損傷，有劑量-效應(yīng)關(guān)系。硅納米粒子尾靜脈注射小鼠，透射電鏡下可見(jiàn)在腦、肝、心、脾、肺等器官組織均有分布。8、13和37 nm三種不同粒徑的Fe2O3納米粒子在細(xì)胞毒性上表現(xiàn)出一定的差異，粒徑分布較小的粒子毒性比大粒徑的粒子要大。隨著粒徑的減小，粒子表面積明顯增加，單位質(zhì)量納米粒子具有更強(qiáng)的生物活性，一些原本無(wú)毒或毒性小的材料開(kāi)始出現(xiàn)毒性或毒性明顯加強(qiáng)。眾所周知以石英為代表的結(jié)晶型

3、SiO2是典型的肺毒物。在納米尺度上，納米SiO2的理化性質(zhì)發(fā)生巨變，其生物學(xué)效應(yīng)的性質(zhì)和強(qiáng)度是否會(huì)發(fā)生質(zhì)的變化？這種新材料可能帶來(lái)的生物安全性方面的問(wèn)題日益受到關(guān)注。有資料顯示：納米SiO2對(duì)大鼠肺部的急性損傷作用比微米SiO2強(qiáng)，但對(duì)大鼠肺部致纖維化作用比微米SiO2弱。納米SiO2在體外對(duì)紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及A549細(xì)胞等均表現(xiàn)出不同程度的毒性作用。 由于尺寸小，機(jī)體對(duì)納米材料的反應(yīng)程度也隨粒徑大小不同而有異。因此，在納米尺

4、度上，除了劑量以外，尺寸大小也是決定納米顆粒毒性大小的一個(gè)重要因素。即使同一種物質(zhì)、同一種形態(tài)、同一個(gè)劑量，只要尺寸大小改變，它們的生物效應(yīng)（尤其是生物毒性）就需要重新測(cè)試評(píng)價(jià)。為此，對(duì)同一納米材料不同粒徑之間可能存在的潛在生物學(xué)效應(yīng)的差異進(jìn)行研究是非常必要的。目前在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)納米SiO2與微米SiO2之間生物學(xué)效應(yīng)存在差異，而對(duì)于不同粒徑納米SiO2潛在生物學(xué)效應(yīng)及其差異性的研究還較少。考慮到游離SiO2進(jìn)入體內(nèi)后引發(fā)巨噬細(xì)

5、胞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，釋放大量細(xì)胞因子，使成纖維細(xì)胞增生，膠原代謝紊亂，最終導(dǎo)致肺纖維化，本課題以微米SiO2為陽(yáng)性對(duì)照，RAW264.7細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）為研究對(duì)象，旨在通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞體外染塵的方法，探討不同粒徑納米SiO2粒子（20-nm、60-nm）的細(xì)胞毒性作用及相關(guān)機(jī)制，比較不同粒徑納米SiO2對(duì)細(xì)胞損傷的差異性及其與微米SiO2的差別，為納米SiO2生物學(xué)效應(yīng)研究及衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定方面提供毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)資料。實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果如下： 1.20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2粉塵體外作用于紅細(xì)胞后，可引起紅細(xì)胞溶血。一定濃度下，20-nmSiO2致紅細(xì)胞溶血率較60-nm SiO2及微米SiO2高（P<0.05）。20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2在一定濃度范圍內(nèi)致紅細(xì)胞產(chǎn)生MDA的量隨其濃度的增加逐漸升高，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（R2>0.9，P<0.01）。相同濃度20-nm SiO2致紅細(xì)胞MDA生成量較60-nm SiO2多（

7、P<0.05）。 2.一定濃度范圍內(nèi)，20-nm、60-nM SiO2（0-24 mg/ml）和微米SiO2（0-32 mg/ml）對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力均有不同程度的抑制作用。MTT法測(cè)得20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2對(duì)RAW264.7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.07、6.82和14.71 mg/ml。光學(xué)和熒光顯微鏡下觀察，500.00μg/ml20-nm、60-nmSiO2及微米SiO2可致

8、貼壁細(xì)胞數(shù)量減少、體積增大、呈氣球樣變。透射電鏡下觀察染毒RAW264.7細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹、嵴斷裂、胞質(zhì)內(nèi)空泡增多。能譜儀分析顯示染毒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中吞噬泡內(nèi)的顆粒和細(xì)胞間隙的顆粒均含有Si元素。 3.125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2致細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性增加（P<0.05）。500.00μg/ml兩種粒徑納米SiO2組LDH活性高于微米SiO2組（P<0.05）。500.00μg/ml20-

9、nm SiO2組LDH活性高于同濃度60-nm SiO2組（P<0.05）。經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)，31.25、125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2組細(xì)胞膜熒光恢復(fù)能力均降低（P<0.05）。500.00μg/ml20-nm SiO2組細(xì)胞膜熒光恢復(fù)能力低于微米SiO2及60-nm SiO2組（P<0.05）。125.00、500.00μg/ml兩種粒徑納米SiO2組細(xì)胞膜擴(kuò)散系數(shù)低于陰性對(duì)照組（P<

10、0.05）。經(jīng)Ca2+敏感探針Fluo-3/AM檢測(cè)得500.00μg/ml兩種粒徑納米SiO2組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量在測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)均升高（P<0.05）；在31.25、125.00μg/ml時(shí)，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量出現(xiàn)瞬間、暫時(shí)性升高，而后又逐漸恢復(fù)至細(xì)胞正常狀態(tài)水平。同濃度下，兩種粒徑納米SiO2致細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量升高的現(xiàn)象較微米SiO2明顯（P<0.05）。個(gè)別作用時(shí)間點(diǎn)，20-nm SiO2致細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i

11、含量升高的作用強(qiáng)于60-nm SiO2（P<0.05）。500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及微米SiO2可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)（MDA、O2-·、·OH、NO、H2O2）水平升高。通過(guò)DCFH-DA熒光探針測(cè)定得125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2組在染毒4h后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平急劇升高。31.25μg/ml20-nm、60-nm SiO2組細(xì)胞內(nèi)活

12、性氧水平在4-8 h之間升高較快，而后呈緩慢升高趨勢(shì)。微米SiO2組在染毒2h、4h、8h、16 h、24 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈直線上升趨勢(shì)，較20-nm、60-nm SiO2組作用明顯。 4.500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及500.00μg/ml微米SiO2染毒RAW264.7細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清液致CHL細(xì)胞增殖率增加（P<0.05）。500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2組上清液致C

13、HL細(xì)胞增殖率低于微米SiO2組（P<0.05）。31.25、125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及500.00μg/ml微米SiO2組上清液致CHL細(xì)胞羥脯氨酸生成量增加（P<0.05）；500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2組羥脯氨酸的生成量高于同濃度微米SiO2組（P<0.05）。125.00、500.00μg/ml兩種粒徑納米SiO2組上清液致CHL細(xì)胞MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率增加（P

14、<0.05）。500.00μg/ml20-nm SiO2組MMP-2陽(yáng)性表達(dá)率高于微米SiO2組及60-nm SiO2組（P<0.05）。125.00、500.00μg/ml20-nm、60-nm SiO2及500.00μg/ml微米SiO2致TGF-β1生成量增加（P<0.05）；125.00μg/ml和500.00μg/ml20-nm SiO2、500.00μg/ml60-nm SiO2及微米SiO2致IL-1β生成量增加（P<0.

15、05）。 以上結(jié)果提示20-nm、60-nm SiO2粒子在導(dǎo)致MDA升高的同時(shí)引起紅細(xì)胞溶血；兩種不同粒徑納米SiO2可通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化作用引起細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞膜流動(dòng)性下降及通透性升高、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平增高，從而使體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制、結(jié)構(gòu)和功能受到損傷；兩種粒徑納米SiO2刺激RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)上清可致細(xì)胞因子TGF-β1、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2釋放量增加，由此