經(jīng)味覺通路的納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒的中樞神經(jīng)毒性.pdf

1、目的：
　　1.舌體滴注納米氧化鋅和納米二氧化鈦兩種混懸液，探索納米顆粒能否通過味覺神經(jīng)通路進入動物體內(nèi)
　　2.評估舌體滴注的納米顆粒通過味覺神經(jīng)通路在動物體內(nèi)沉積的含量
　　3.檢測氧化應激相關指標，評估納米顆粒的中樞神經(jīng)毒性作用
　　4.腦組織形態(tài)學觀察和免疫組化分析，探索納米顆粒進入動物體內(nèi)對中樞神經(jīng)毒性的影響
　　5.采用水迷宮實驗探索納米顆粒對大鼠空間記憶及學習認知功能的影響本論文主要包括以下兩

2、章內(nèi)容:
　　第一章 納米顆粒通過味覺神經(jīng)通路進入Wistar大鼠
　　材料與方法：
　　1.納米材料的表征
　　1)透射電子顯微鏡(TEM)觀察表面形貌
　　使用TEM觀察納米氧化鋅和納米二氧化鈦的形態(tài)和結構，計算納米氧化鋅和納米二氧化鈦的平均粒徑。
　　2)納米材料化學成分的分析
　　采用X線光譜儀(EDS)對納米氧化鋅和納米二氧化鈦進行化學成分分析。
　　3)X射線衍射物相分析(XR

3、D)
　　采用XRD設備分析納米氧化鋅和納米二氧化鈦的晶相，在室溫下，采用Ni過濾的Cu-Kα射線進行。
　　2.動物模型的構建及神經(jīng)和腦組織元素含量檢測
　　1)配液用天平分別稱量1.5 g的納米氧化鋅和納米二氧化鈦粉末，分別倒入裝有30mL無菌水的100 mL血清瓶中，用標簽紙在瓶蓋上分別標記為“納米氧化鋅”和“納米二氧化鈦”。使用漩渦混勻器大力混勻，溶液濃度為50 mg/mL。將裝有納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液

4、的血清瓶放入水浴鍋進行加熱，當水浴鍋溫度達到85-100℃時，用天平分別稱量0.3 g羥丙基甲基纖維素(HPMC)按照1％的比例，分別加入到納米氧化鋅和納米二氧化鈦血清瓶中。
　　2)超聲混勻
　　將配置好的混懸液放入超聲機中，頻率調(diào)至95％，溫度調(diào)至40℃，超聲90min，反復多次超聲。每次給藥前將配置好的混懸液再次加熱，用漩渦混勻器大力混勻，瓶底無沉淀后，放入超聲機中超聲約30 min，直至藥物均勻分散，無沉積，無明顯團

5、聚現(xiàn)象即可。
　　3)動物的選擇
　　從南方醫(yī)科大學動物中心購買體重為120-150 g的成年雄性Wistar大鼠30只，隨機分組，其中納米氧化鋅組、納米二氧化鈦組、對照組各10只，要求大鼠身體健康，活動度正常，毛發(fā)色澤及密度正常。
　　3.腦組織及神經(jīng)組織透射電子顯微鏡的檢測
　　分別提取納米氧化鋅組，納米二氧化鈦組和對照組大鼠的海馬，大腦皮層和神經(jīng)組織（鼓索），放入固定液中固定，然后取出包埋，切片，觀察組織中

6、是否存在納米顆粒，及組織的損傷情況。
　　結果：
　　1.表征結果顯示，納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒純度高，無雜質(zhì)，粒徑為50 nm，制備的納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液分散均勻，無明顯團聚或沉淀。
　　2.采用ICP-MS檢測納米氧化鋅組Zn元素含量，納米二氧化鈦組Ti元素含量，與對照組的Zn元素和Ti元素分別進行比較，發(fā)現(xiàn)實驗組神經(jīng)組織和腦組織（小腦，腦干，大腦皮層，海馬）的Zn元素和Ti元素明顯高于對照組，差異具

7、有統(tǒng)計學意義。
　　3.腦組織和神經(jīng)組織的TEM結果顯示，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層均可見組織中有散在的納米顆粒沉積，部分細胞及細胞器形態(tài)改變，如線粒體腫脹、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，膠質(zhì)細胞出現(xiàn)核固縮，核固裂，神經(jīng)元凹陷，胞質(zhì)空，板層松解，形成空泡，髓鞘軸漿萎縮，形成空泡，還可見自噬體、溶酶體形成。對照組未見明顯的納米顆粒沉積，細胞及細胞器形態(tài)良好。
　　第二章 納米顆粒通過味覺神經(jīng)通路入腦的神經(jīng)毒性
　　材料與

8、方法：
　　1.納米顆粒對腦組織的氧化應激損傷
　　1)將冰凍的樣本取出，分別提取納米氧化鋅，納米二氧化鈦，對照組的腦組織0.2 g，生理鹽水稀釋，盡可能保證樣品在4℃環(huán)境中，使用組織勻漿機制備組織勻漿(1∶9 w/v)，約3-5次，每次間隔30-60 s，共約10 min，離心，轉速2500 r/min，收集上清液。
　　2)分別檢測超氧化物歧化酶(SOD)的活性，丙二醛(MDA)的含量，還原型谷胱甘肽(GSH)的含

9、量，谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)的含量，谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。根據(jù)說明書添加相應試劑。在96孔板上進行種板，采用熒光酶標儀測量熒光強度，激發(fā)和發(fā)射波長。
　　3)氧化應激相關基因的表達
　　收集不同組大鼠的腦組織，制作組織勻漿后，提取總RNA，即刻逆轉錄成cDNA，采用qRT-PCR法檢測氧化應激相關基因，如Dhcr7、Cyp51、Gsr、Nox1、Sod2、Nqo1、Fmo2表達水平的

10、改變。選擇大鼠的β-actin基因作為內(nèi)參。
　　2.腦組織形態(tài)學觀察及免疫組化分析
　　1)將取出的腦組織固定，石蠟包埋，用切片機切片，切片厚度約4μm。
　　2)將切片進行蘇木精-伊紅染色(HE)，正置光學顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學改變。
　　3)免疫組化分析，采用Ki-67觀察增殖細胞的存在，采用八羥脫氧鳥苷酸(8-OHDG)觀察DNA損傷情況，采用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)觀察星形膠質(zhì)細胞的存在，隨機

11、選擇大腦皮層和海馬組織的區(qū)域，進行拍照（棕色）。
　　3.動物行為學分析納米顆粒產(chǎn)生的潛在中樞神經(jīng)毒性
　　1)水迷宮為一個直徑約2.0 rn的圓鋼管混凝土，深度約80 cm，水溫基本恒定在26℃，填滿水后添加不透明的黑色墨水。水池分為四個象限:東北(NE)，東南(SE)、西南(SW)和西北(NW)。內(nèi)置一個圓形平臺（直徑10 cm），置于象限中央，水面高度控制在圓形平臺上方2 cm的位置。
　　2)記錄大鼠1-7 d

12、在水迷宮尋找平臺所用的時間和運動軌跡。
　　3)采用SPSS20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，測定結果采用重復測量方差分析和多元方差分析，進行不同時間點和不同組間的兩兩比較，檢驗方差齊性，檢驗水準α=0.05。
　　結果：
　　1.納米顆粒對腦組織氧化應激損傷的檢測
　　1)納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組SOD的活性均顯著低于對照組，提示組織抗氧化能力下降。納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組MDA的含量均顯著高于對照

13、組，提示組織出現(xiàn)了脂質(zhì)過氧化。納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組GSH，GSH-Px，GSH/GSSG的含量均顯著低于對照組，提示組織抗氧化能力下降，出現(xiàn)了氧化應激損傷。
　　2)與對照組比較，兩組實驗組Dhcr7表達顯著下調(diào)、Cyp51和Nqo1表達顯著上調(diào)、納米氧化鋅組Gsr和Fmo2表達顯著上調(diào)、納米二氧化鈦組Sod2表達顯著上調(diào)、兩組實驗組Nox1表達水平無顯著性差異，提示組織氧化應激相關基因表達水平改變，可能出現(xiàn)了氧化應激損傷

14、。
　　2.腦組織形態(tài)學觀察及免疫組化分析
　　1)在正置顯微鏡下觀察可見，HE染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中，可見組織松解，出現(xiàn)裂隙，細胞排列松散，對照組組織未見明顯異常，說明實驗組腦組織發(fā)生了一定程度的病理改變。
　　2)在正置顯微鏡下觀察可見，Ki-67染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中，增殖細胞數(shù)目較對照組少;8-OHDG染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬

15、中，DNA損傷的細胞數(shù)目較對照組多;GFAP染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中，星形膠質(zhì)細胞數(shù)目較對照組多;說明實驗組腦組織出現(xiàn)了損傷，細胞增殖能力下降，可能出現(xiàn)神經(jīng)退化。
　　3.納米顆粒產(chǎn)生的腦毒性對動物行為學分析的影響
　　1)在第1、2、3、5、8d，納米氧化鋅組大鼠尋找平臺的時間明顯長于對照組，具有統(tǒng)計學差異。在第6d，納米氧化鋅組大鼠經(jīng)過平臺并停留的時間明顯短于對照組，具有統(tǒng)計學差異。
　

16、　2)在第2、3、4、5、8d，納米二氧化鈦組大鼠尋找平臺的時間明顯長于對照組，具有統(tǒng)計學差異。在第6d，納米二氧化鈦組大鼠經(jīng)過平臺并停留的時間明顯短于對照組，具有統(tǒng)計學差異。
　　3)與對照組比較，兩組實驗組Sgk1、Drd2、Trappc4、Gnaq表達均顯著下調(diào)，提示腦組織學習記憶相關基因的表達改變，可能具有中樞神經(jīng)損傷。
　　結論：
　　1.通過對Wistar大鼠舌體滴注納米顆粒的方式給藥30d，納米顆粒可在腦

17、組織中沉積。
　　2.采用氧化應激試劑盒進行檢測，發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組腦組織清除超氧陰離子自由基的SOD活性降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高，GSH，GSH-Px，GSH/GSSG下降，提示腦組織抗氧化能力下降，發(fā)生了氧化應激的損傷。
　　3.組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬組織松解，細胞排列松散，提示腦組織發(fā)生了病理改變。
　　4.免疫組化分析，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組

18、大腦皮層和海馬組織細胞增殖能力下降，出現(xiàn)了DNA損傷，可能還有神經(jīng)退化。
　　5.氧化應激相關基因表達水平部分出現(xiàn)了上調(diào)或下調(diào)，說明腦組織氧化應激相關基因表達水平改變，進一步提示腦組織發(fā)生了氧化應激損傷。
　　6.行為學分析發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大鼠的認知和學習記憶能力較對照組下降，說明納米顆粒引起了腦組織的學習記憶和認知功能的障礙。
　　7.學習記憶相關基因表達水平均出現(xiàn)了下調(diào)，說明腦組織學習記憶相關基因