生物炭對(duì)煙草類胡蘿卜素代謝的影響及LCY-b基因過(guò)表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、為闡明添加生物炭對(duì)煙草類胡蘿卜素代謝的影響機(jī)制，本試驗(yàn)以煙草品種K326為材料，在大田試驗(yàn)中設(shè)置不同的生物炭處理，從煙株發(fā)育過(guò)程中葉片類胡蘿卜素積累動(dòng)態(tài)、類胡蘿卜素代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)和烤后樣中性致香物質(zhì)三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在此基礎(chǔ)上，以類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵分支點(diǎn)酶LCY-b為切入點(diǎn)，通過(guò)同源克隆的方法獲得煙草品種K326LCY-b基因全長(zhǎng)序列，利用in-fusion方法成功構(gòu)建了LCY-b基因過(guò)表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化

2、煙草植株，得到LCY-b過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株共6株。將T0代陽(yáng)性植株進(jìn)行大田種植，進(jìn)一步探究LCY-b基因?qū)煵蓊惡}卜素代謝及烤后樣中性致香物質(zhì)的影響，為煙草類胡蘿卜素代謝的分子調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.不同生物炭肥施用量對(duì)煙草類胡蘿卜素代謝影響的分析結(jié)果表明：隨著煙葉成熟，類胡蘿卜素合成相關(guān)基因（PSY、ZDS、LCY-b）表達(dá)逐漸減弱，降解相關(guān)基因（CCD1）表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與打頂后類胡蘿卜素含量逐漸下降的結(jié)果一致

3、。煙葉成熟后期，添加生物炭的處理類胡蘿卜素積累量較多，其中T1（300kg?hm-2）處理的類胡蘿卜素各組分含量在打頂后一直保持在較高水平。RT-PCR分析結(jié)果顯示：T1（300kg?hm-2）和T2（600kg?hm-2）處理中類胡蘿卜素合成及降解相關(guān)基因的表達(dá)量相對(duì)較強(qiáng)，說(shuō)明適量添加生物炭肥對(duì)煙葉類胡蘿卜素的合成和降解均有明顯的促進(jìn)作用，整體上減緩了類胡蘿卜素含量下降趨勢(shì)，提高了成熟期煙葉類胡蘿卜素積累量。煙葉調(diào)制后，T1處理的類胡

4、蘿卜素降解產(chǎn)物含量最高，未添加生物炭肥的處理含量最低。以上結(jié)果說(shuō)明，適量添加生物炭能夠增強(qiáng)類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶活性，有利于成熟期煙葉類胡蘿卜素的積累及調(diào)制后中性致香物質(zhì)的形成。
　　2.采用同源克隆的方法獲得煙草LCY-b基因全長(zhǎng)序列1557bp，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。序列分析表明：K326LCY-b基因包含一個(gè)1503bp的開(kāi)放讀碼框（ORF），編碼500個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為56.05KDa，理論等電點(diǎn)（pI

5、）為6.68。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。
　　3.利用in-fusion方法成功構(gòu)建LCY-b過(guò)表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草植株，獲得LCY-b過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株。分子檢測(cè)證明LCY-b基因在煙草基因組中成功實(shí)現(xiàn)了整合和轉(zhuǎn)錄。過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株的qPCR檢測(cè)結(jié)果表明：部分轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株LCY-b基因的表達(dá)量顯著高于K326對(duì)照。相應(yīng)地，類胡蘿卜素組分中的β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)所占比例增加，而葉黃素所占比